发酵液中手性扁桃酸的分离纯化.doc

发酵液中手性扁桃酸的分离纯化 陈剑锋”，毕鸣波”，肖美添”，黄雅燕”，方倩”，郭养浩2 (1福州大学生物科学与工程学院福建福州350002) (2福州大学药物生物技术与工程研究所福建福州350002) (3华侨大学化工系福建泉州362011) 擅要：采用pH值电位滴定法测定了手性药物中间体扁挑酸的pK值为5．28，考察了扁桃酸在不同溶剂中的溶解 度差异和在不同pH值苯～水体系中的分配率，建立了热苯萃取和低温结晶的扁桃酸纯化工艺。对两种阳树脂和 四种阴树脂进行筛选，建立了发酵液中手性扁桃酸的711树脂动态吸附、动态解吸和732树脂转型的离子交换 分离工艺。验证实验结果显示，扁桃酸的收率为87．8％，纯度≥90％。 关键词：手性，R一{一卜扁桃酸，生物不对称合成，发酵液，分离，纯化 手性合成技术已成为当今世界生物制药和有机化学的研究热点。药物手性化已成为国际新药 研究和开发的方向之一。目前国际市场上手性药物的生产主要采用化学拆分和生物拆分方法从外 消旋体混合物中制备，目标产物理论得率小于50％。利用中间体生物不对称合成手性药物不仅可 以简化合成路线，同时可以减少外消旋体制备法中不必要异构体的生成及“三废”的排放，实现 手性药物的绿色化学生产。 扁桃酸(mandelic acid)是重要的手性药物中间体和精细化工中间体，可用于合成血管 扩张药环扁桃酯、细菌性尿路感染消炎药扁桃酸乌洛托品、镇痉药扁桃酸苄酯等药物。目前国 际市场上扁桃酸需求约以年均10％的速度增长，2000年我国扁桃酸消费量约为250吨“1。至今 为止，国内未见采用苯乙酮酸为中间体生物不对称合成单一光学对映体(R一扁桃酸或s一扁桃酸) 的报导，从发酵液中提取R一扁桃酸更未见报道。扁桃酸分子结构示于图1。 图1扁桃酸分子结构 1材料与方法 1．1材料 苯乙酮酸购自台州药业医化有限公司；标准品R(一)一扁桃酸和s(+)一扁桃酸购自Sigma 公司。甲醇(色谱纯)和磷酸二氢钾(优质纯)购自江苏汉邦科技有限公司；苯、环乙烷、三 氯甲烷、四氯化碳、乙醚、氯化钠、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、异丙醇，均为分析纯，购自广东 西陇化工厂；扁桃酸发酵液由本课题组生产提供，酵母菌株(Saccharomyces Cerevisiae sp． strain byl)为本所保藏菌种。732和D186阳离子交换树脂、711、D315、335和D345阴离子 交换树脂，均由上海华震公司馈赠。so‘2_、cl一、ca“、M92+试剂盒，购自福州市药检所。 基金项目：福建省计委(婀计45号)、闽科委重点(2003H023)和阉自然科学基金(E0310019)资助项目。 作者简介：陈剑锋(1960一)，男(汉族)，福建福鼎市人，博士，副教授，硕士生导师：研究方向：生物化 ：[和制药工程。TelE-mail：j!￡鱼!缱l型：2盘：￡卧 通信联系人：郭养浩，男，教授，博士生导师：TelE-mail：bioeng@fzu．edu．cn。  1．2仪器 pH／ACETMMD0型毛细管电泳仪，Bekman公司；高效液相色谱，【Iv检测器(SPD一10A)，SHIMAD2U 公司；C18反相柱，中4．6×250 mm，5 m，Bekman公司；Mettler Toled 320一S型pH计，Mettler 公司；Cary50型紫外分光光度计，Varian公司；Bekman AllegraTM 64R型高速离心机，Behman 公司；兰格BT—100型蠕动泵，保定兰格衡流泵有限公司：循环水式多用真空泵，兰州长城科贸 有限公司；WXJ一9388型紫外检测仪，康特高科生物仪器有限公司；BSZ—i00型自动分部收集器， 上海沪西分析仪器总厂；Dz一1型自动电位滴定装置，上海雷磁仪器厂；ZFQ一85A旋转蒸发器， 上海医械专机厂：zK一82A真空干燥箱，上海市实验仪器总厂；Sartorius BL310电子天平， Sartorius公司；KQl00型超声波清洗器，宁波超声波仪器厂；数显恒温水浴锅，国华电器有限 公司；mJHA I-2 LD型冷冻干燥机，德国CHRIST公司；超滤系统，福建省福龙科技开发公司。 1．3分析方法 1．3．1扁桃酸浓度分析”I：苯乙酮酸和扁桃酸的浓度采用高效液相色谱仪分析，UV检测器，检 测波长220 rhrn，C：B色谱柱(中4．6x 2 50 mm，5 m)，流动相：50mmol／L磷酸盐缓冲液(pH 6．80)’ 甲醇：9：1(V／V)，流速1．0 ml／min，柱温30。C。将苯乙酮酸和扁桃酸标样用水稀释成一系列 倍数关系的浓度，然后将不同浓度的标准样品分别用HPLC测定，每次迸样20 l，每个浓度实 验重复3次，误差±o．548％，取进样的浓