扩增效率荧光定量PCR原理.pptVIP

Thanks！ * * * * * * * * * 内容概要 荧光定量PCR的原理 荧光定量PCR的标记方法 荧光定量PCR解析方法 荧光定量实验流程及注意事项 生工荧光定量产品选择指南 * 荧光定量PCR的解析方法 绝对定量解析方法 相对定量解析方法 * 绝对定量的定义 * Sample 25 Log（起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品 可作出标准曲线,即得到该扩增反应存在的线性关系 根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量 绝对定量分析几要素 * 一个目的基因 ——即需要确定其量值的核酸序列。 一组标准样本 ——用来生成标准曲线。可以是含有目的基因的质粒、PCR产物、基因组DNA等。 重复反应孔 –——建议每个样本使用三个或更多重复反应，以确保统计显著性。 标记方法的选择 ——SYBR Green I 法或Taqman 探针法均可。 实验结果显示 ——扩增曲线；标准曲线；融解曲线(探针法不需要)。 绝对定量质粒标准品的制备 * PCR 目的基因克隆 目的基因 目的基因 目的基因 质粒 目的基因 基因组DNA 质粒提取，OD值定量，将质粒梯度稀释作为标准品使用 质粒标准品稀释方法与拷贝数计算 * 倍比梯度稀释方法： 1v原液(标准品i) +9v稀释缓冲液，得标准品ii 1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii 1v标准品iii +9v稀释缓冲液，得标准品iv 1v标准品iv +9v稀释缓冲液，得标准品v 拷贝数的计算： 待测样本浓度（ng/ul）=OD260×40×稀释倍数 样本分子量=碱基数×324 待测样本拷贝数（copies/ul）=待测样本浓度/样本分子量×6×1014 绝对定量实验例－－乙肝病人血液中HBV的绝对定量 * 方法：从血液中提取病毒DNA，以TaqMan探针法进行荧光定量检测 标准品：质粒标准品浓度为106、105 、104 、 103；2个重复；设阴性空白对照 实验步骤：提取HBV DNA； 设计特异引物； 设计TaqMan探针并标记探针； 荧光定量扩增； 结果分析：获取血液样品中HBV DNA的精确copy数。 绝对定量实验例－－乙肝病人血液中HBV的绝对定量 * Sample copies/ml Ct1 Ct2 Mean Ct STD 标准品 5×103 28.18 28.64 28.41 0.16 标准品 5×104 25.25 25.14 25.19 0.04 标准品 5×105 22.11 22.46 22.28 0.12 标准品 5×106 18.63 18.92 18.77 0.10 未知样品 ? 20.56 20.45 20.5 0.05 空白对照 None None 绝对定量实验例－－乙肝病人血液中HBV的绝对定量 * 扩增效率（E）计算 E =10-1/斜率 -1 =10-1/-3.29 -1 =2.01-1 =1.01 标准曲线制作：利用Mean Ct 作图可得到标准曲线 y = -3.29x + 40.33 R2 = 0.9978 相关系数（R2）：大于0.98，越接近1，结果可信度越高。 扩增效率（E）：0.8-1.2, 越接近1，越理想。 绝对定量实验例－－乙肝病人血液中HBV的绝对定量 * 未知样品拷贝数的计算 将Ct值带入线性方程： 20.5= -3.29 X + 40.33 QuantityUnknown=10 6.03 =1,071,519 copies X= 20.5-40.33 -3.29 =6.03 荧光定量PCR的解析方法 绝对定量解析方法 相对定量解析方法 * 相对定量的必要性 * Sample B Sample A 目的基因扩增效率相同 RNA提取效率相同 细胞起始数相同 实际目的基因表达量分析 相对定量分析方法 * 比较两个或两个以上样本中某个基因表达量的变化！ 关注点：基因的相对表达量，而不是基因的绝对量！ 相对定量分析几要素 * 一个参照样本 一个或一个以上的未知样本 一个目的基因 管家基因——用来校对不同样本之间目的基因的实际表达量 重复反应孔——建议每个样本使用三个或更多重复反应，以确保统计显著性 标记方法的选择——SYBR Green法或探针法均可 实验结果显示——扩增曲线；标准曲线（有些分析方法不需要）；融解曲线（探针法不需要） 一