土鳖虫 DNA 的RAMP-PCR 反应体系的建立及优化.PDFVIP

中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 6 期 2014 年 3 月 ·835 · 土鳖虫 DNA 的RAMP-PCR 反应体系的建立及优化 1 1 2 1 1* 王 慧 ，苏双良 ，任慧君 ，赵志壮 ，白秀娟 1. 东北农业大学动物科学技术学院，黑龙江 哈尔滨 150030 2. 东北农业大学生命科学学院，黑龙江 哈尔滨 150030 摘 要：目的 建立并优化土鳖虫基因组 DNA 的RAMP-PCR 反应体系及扩增程序，为土鳖虫遗传多样性的研究提供依据。方法 以 雌性土鳖虫为材料，常规酚/氯仿提取基因组 DNA 。使用RAMP 引物（ISSR807＋RAPD A5 ），采用正交优化方法对影响PCR 反 应的 Mg2+ 、dNTPs、引物、DNA 聚合酶、模板进行体系优化，同时选择最佳的引物退火温度。结果 最适引物（ISSR807＋RAPD A5 ）组合进行土鳖虫的 RAMP-PCR 分析的反应体系为总体积 25 μL ，包括 10×缓冲液2.5 μL 、Mg2+ 1.00 mmol/L 、dNTPs 2.00 mmol/L 、引物 0.50 μmol/L 、TaqDNA 聚合酶 1.00 U、DNA 模板 1.50 ng/μL ，最佳退火温度为46.8 ℃。结论 本实验建立的 最佳 RAMP-PCR 反应体系稳定、重复性好，可用于土鳖虫种质资源鉴定和遗传多样性研究。 关键词：土鳖虫；正交试验；体系优化；RAMP-PCR 体系；遗传多样性 中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2014)06 - 0835 - 05 DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.06.018 Establishment and optimization of RAMP-PCR reaction system for DNA of Eupolyphaga sinensis 1 1 2 1 1 WANG Hui , SU Shuang-liang , REN Hui-jun , ZHAO Zhi-zhuang , BAI Xiu-juan 1. College of Animal Science and Technology, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China 2. College of Life Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China Abstract: Objective To provide the basis for the genetic diversity research of Eupolyphaga sinensis by establishing and optimizing the random amplified microsatellite polymorphism RAMP-PCR reaction system and amplification procedure for genomic DNA. Methods Phenol chloroform extraction of genomic DNA was performed on female E. sinensis. Based on RAMP Primer (ISSR807 + RAPD A5), the orthogonal test was adopted to optimize the RAMP-PCR amplification system on E . sinensis in five factors (Mg2+, dNTPs, primer, Taq DNA polymerase, and template DNA) at four levels, and the suitable a