流式分析药物抑制结肠癌细胞增殖及相关机理研究试验时间.PDFVIP

一、实验名称：流式分析药物抑制结肠癌细胞增殖及相关机理研究 二、实验时间：2014.4.1-2014.5.26 三、实验材料与实验仪器： 1. 实验试剂及耗材： 药物由客户提供；人结肠癌细胞SW480 购自中国科学院上海生命科学研究院细 胞库；RPMI-1640 培养基购自Life 公司；胎牛血清购自GBICO 公司；胰酶购自 武汉博士德生物公司；DMSO 购自sigma；端粒酶活性检测试剂盒购自Roche 公 司；MTT 检测试剂盒购、Benzamidine 和DTT 自上海生工；RNA 酶抑制剂和Lysis Buffer 购自碧云天生物；无水乙醇购自国药集团；BAC 蛋白定量试剂盒购自上 海生工；酶标板购自Corning 公司；鼠抗人CD133-PE ，鼠抗人CD44-APC 和鼠 抗人ESA-FITC 单抗均购自美国BD 公司； 相关耗材(Tip 头、EP 管、PCR 管)购自Axygen 公司。 2. 实验仪器：台式离心机（德国 Eppendorf 公司）；酶标仪（Molecular Devices 公司）；FACS Calibur 流式细胞仪（美国BD 公司）；PCR 仪（美国Bio-Rad 公司）。 四、实验方法与操作步骤： 1 SW480 细胞培养 SW480 细胞培养及其癌细胞球培养：人结肠癌细胞株SW480 在1640 培养基（含 10% FBS，1%青链霉素）中进行培养，置于 37℃、5%CO2 的细胞培养箱，每 2-3d 传代一次。当细胞密度比较高时，用含0.25%胰酶和0.05%EDTA 的消化液 消化传代细胞，细胞变圆，连接消失后用完全培养基终止消化。 （1）细胞复苏 1）从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。 2 ）从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并 滴加10 倍以上培养液，混匀。 3 ）离心（1000rpm，5min ），弃去上清液，加入培养液重悬细胞，计数，调整 细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养。 4 ）次日更换一次培养液，继续培养。 （2 ）细胞冻存 1）配置冻存液：10%DMSO，90%小牛血清。 ________________________________________________________________________ 2 ）取重悬细胞，离心（1000rpm， 5min ），弃上清，加入冻存液，计数，调整 细胞终密度为5×106/mL。 3 ）加入冻存管，每管1-1.5mL 4 ）4 ℃静置 10min，-20 ℃冻存2 小时，-80℃过夜。取出冻存管，移入液氮容器 内。 （3 ）细胞传代培养 1）吸光培养基，加入2 mL 0.25 ％的胰蛋白酶液( 以消化液能覆盖整个瓶底为准） 静置8 min （显微镜下动态监测）。 2 ）加入6 倍体积培养基，终止消化，吹打，悬浮细胞。 3 ）离心（1000rpm， 5min ），弃上清，加培养基，吹打沉淀，形成重悬细胞。 4 ）取1/10 接种于新培养瓶中，加入培养基，在5%CO2 细胞培养箱中培养。 2 铺板 细胞计数后，接种96 孔板。每孔接种细胞数 104，每个给药浓度铺6 个平行重 复孔，用0.1%DMSO 培养基和0.1%无水乙醇培养基做对照组，铺板24h后给药。 3 给药培养 用 DMSO 溶解配置和纳米颗粒母液至 1000nmol/L，分别配置含和纳米颗粒 1nmol/L、10nmol/L、50nmol/L、100nmol/L 的10%血清培养基。分别对对应细胞 孔给药，继续培养48h 后在显微镜下拍摄细胞，观察细胞形态，并进行MTT 实验。 4 MTT 检测 1）按照试剂盒要求配置MTT 溶液，浓度为5mg/mL。 2 ）每孔加入培养基终体积1/10 MTT 溶液，37℃细胞培养箱内孵育4hr 。 3 ）终止培养，小心吸去孔内培养液。 4 ）加入100μL MTT 显色液，摇床低速震荡10 分钟。 5 ）在570nm 处测定吸光值。（细胞存活率：（实验组OD-调零组OD ）/ （对照 组OD-调零组OD ）） 5 端粒酶提取 （PCR-TRAT-Elisa 端粒酶活性检测试剂盒检测大肠癌 sw480 细胞端粒酶活性 （端粒酶活性检测试剂盒，Roche 公司，#12013789001 ）） 1）按105/mL 接种6 孔培养板，每