第六章节 酶固定化和修饰-4.pptVIP

第四节酶固定化和酶分子的化学修饰 第一 酶固定化 一、为什么开展酶的固定化技术？ 游离酶的一些不足之处： （1）酶的稳定性较差 （2）酶的一次性使用 （3）产物的分离纯化较困难 固定化酶是被固定在某一有限空间内不再能自由流动而仍有催化活性的酶。 固定化酶是20世纪50年代发展起来的一项技术 1969年固定化氨基酸酸化酶在工业生产中被正式应用 1971年的第一届国际酶工程会议上，正式 采用固定化酶（immobilized enzyme） 固定化酶的优点 优点： —易于将酶与底物及产物分离，因而产物相对容易提纯； — 酶能够重复利用，使用效率提高，成本低； —大多数情况下可以提高酶的稳定性； —可以增加产物的收率，提高产物质量； —有利于实现管道化、连续化以及自动化操作，易于与各种分离手段联用。 固定化酶的缺点 但由于固定化酶是通过反应而被结合在载体上，固定化过程中酶的活力难免有一定损失； 而底物则要求是水溶性的，这样才能够接触酶而发生反应； 也不适宜于需要辅助因子的反应。 胞内酶必须经过酶的分离过程 二、酶的固定化方法 1.载体结合法 通常有物理吸附、离子吸附及螯合或共价结合法。 常用的载体如淀粉、谷蛋白等有机类载体，活性炭、多孔玻璃、硅胶等无机类载体，大孔型的合成树脂，陶瓷以及纤维素衍生物类。阴、阳离子交换剂 2、包埋法(Entrapment) 包埋法是将游离酶包埋于格子或微胶囊内，格子的结构可以防止酶渗出到周围的培养基中，而底物分子仍能渗入格子内与酶接触。 包埋类型可有：网格型、微囊型及脂质体液膜型。 3、共价交联法 共价交联法是通过双功能试剂或多功能试剂，在酶分子间或酶分子和载体间形成共价键的连接方法。 交联剂：具有两种相同或不同功能基团的试剂 固定化酶的应用 固定化酶既保持了酶的催化特性，又克服了游离酶的不足之处，具有如下显著的优点： （1）酶的稳定性增加，减少温度、pH值、有机溶剂和其他外界因素对酶的活力的影响，可以较长期地保持较高的酶活力。 （2）固定化酶可反复使用或连续使用较长时间，提高酶的利用价值，降低生产成本。 （3）固定化酶易于和反应产物分开，有利于产物的分离纯化，从而提高产品质量。 固定化酶已广泛地应用于食品、轻工、医药、化工、分析、环保、能源和科学研究等领域。 第二 酶分子的改造 酶的活性中心（active site） 一、活性中心的概念 酶的必需基团(essential group): 与酶活性有关的基团 酶的活性中心(active center): 由必需基团构成的与酶催化活性有关的特定区域. * * 二、什么是固定化酶？ 水溶性酶 水不溶性载体 固定化技术 水不溶性酶 （固定化酶） Interaction 载体结合法 包埋法 物理吸附 离子结合 微胶囊 聚合物包埋 Procedure in bath in situ 共价交联法 固定化酶的模式图 仅可用于低分子量的底物，不适用于柱系统，常有扩散限制问题 包埋材料、包埋方法可选余地大，固定化酶的使用面广，包埋条件温和 包埋法 交联条件激烈，机械性能差 可用的交联试剂多，技术简易，酶的结合力强，稳定性高 交联法 偶联条件激烈，易引起酶失活；成本高 酶分子的官能团和载体表面的基团发生反应；酶的结合力强，非常稳定 共价法 结合力弱，对pH、离子强度、温度等因素敏感，酶易脱落，酶的装载容量较小 制作条件温和、简便、成本低、载体再生、可反复使用 吸附法 缺 点 优 点 方 法 各种酶固定化方法的比较 酶的活性中心 酶化学修饰的目的 酶化学修饰的原理 酶化学修饰的设计 酶分子 非必需基团 必需基团 活性中心 必需基团 活性中心外 必需基团 结合基团 催化基团 非活性中心 活性中心 活性中心的重要化学基团 7种氨基酸出现的频率最高 Lys Asp Glu Cys His Tyr Ser 某些功能基团,如（氨基、羧基、巯基、羟基 和咪唑基）是酶的必需基团。 赖氨酸的氨基 天冬氨酸和谷氨酸的羧基 半胱氨酸的巯基 组氨酸的咪唑基 酪氨酸和丝氨酸的羟基 与底物相结合，使底物与酶的一定构象形成复合物 影响底物中某些化学键的稳定，催化底物发生化学反应并将其转化成产物 维持酶活性中心应有空间构象所必需的基团 二、活性中心的共性 (1)活性部位只占酶分子很小的一部分（1-2%）。 (2)活性部位是一个三维实体。 (3)活性中心位于酶分子表面的疏水性裂缝中。 (4)活性中心构象不是固定不变的（诱导契合）。 (5)酶与底物通过盐键、氢键、范德华力和疏水作 用等次级键结合。 三、酶分子修饰及修饰目的 一）酶分子修