苏云金芽孢杆菌BJH705菌株cry7Ab基因的克隆及表达-江苏农业科学.PDF

江苏农业科学　２０１７年第４５卷第１４期 — ８５— 韩　超，王丽娟，李海涛，等．苏云金芽孢杆菌ＢＪＨ７０５菌株ｃｒｙ７Ａｂ基因的克隆及表达［Ｊ］．江苏农业科学，２０１７，４５（１４）：８５－８８． ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０１７．１４．０２４ 苏云金芽孢杆菌ＢＪＨ７０５菌株ｃｒｙ７Ａｂ基因的克隆及表达 韩　超，王丽娟，李海涛，刘荣梅，高继国，张　月 （东北农业大学，黑龙江哈尔滨 １６０４０７） 　　摘要：从海南地区土壤中分离得到１株苏云金芽孢杆菌（Ｂｔ）ＢＪＨ７０５。经ＰＣＲ鉴定结果显示，该菌中含有ｃｒｙ７Ａｂ 类基因，其晶体形态为双锥形；以全长引物对其进行扩增，得到大小为３４１７ｂｐ的片段；通过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ结果显示，此 菌株Ｃｒｙ７Ａｂ杀虫晶体蛋白分子量约为１３０ｋｕ，编码１１３９个氨基酸残基，等电点为４．８３；序列已提交ＧｅｎＢａｎｋ注册， 登录号为ＫＸ０１０６６９；对Ｃｒｙ７Ａｂ蛋白的跨膜区域进行分析，得到此蛋白由亲水域和疏水域形成跨膜区，其跨膜区大约 由１９个疏水氨基酸组成，经Ｃｒｙ７Ａｂ蛋白保守结构域分析含有３个结构域。 　　关键词：苏云金芽孢杆菌；ｃｒｙ７Ａｂ基因；克隆；表达；杀虫晶体蛋白 　　中图分类号：Ｑ７８６　　文献标志码：Ａ　　文章编号：１００２－１３０２（２０１７）１４－００８５－０３ 　　在世界范围内广泛分布着一种革兰氏阳性菌———苏云金 ［１］ １　材料与方法 芽孢杆菌（Ｂｔ），其归类于芽孢杆菌科芽孢杆菌属 。它的母 细胞会在形成芽孢的同时伴随着形成晶体蛋白，称之为伴胞 １．１　材料 晶体，伴胞晶体呈现立方体、球形、菱形、镶嵌形、无定形，是具 液体 ＬＢ培养基：０．５％酵母粉，１．０％胰蛋白胨，１．０％ 有杀伤活力的杀虫晶体蛋白。 ＮａＣｌ，ｐＨ值为７．０，１２１℃高温高压灭菌２０ｍｉｎ。 由ｃｒｙ７类基因编码的蛋白的分子量约为１３０ｋｕ，晶体一 固体 ＬＢ培养基：０．５％酵母粉，１．０％胰蛋白胨，１．０％ 般为双锥形。到目前为止，Ｃｒｉｃｋｍｏｒｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌｉｆｅｓｃｉ． ＮａＣｌ，１．３％琼脂，ｐＨ值为７．０，１２１℃高温高压灭菌２０ｍｉｎ。 ｓｕｓｓｅｘ．ａｃ．ｕｋ／ｈｏｍｅ／Ｎｅｉｌ＿Ｃｒｉｃｋｍｏｒｅ／）上已经登录了ｃｒｙ７类２１ ＴａｑＤＮＡ聚合酶、ＫＯＤ酶、ｐＭＤ１９－Ｔ载体、氨苄青霉素、 种基因，共３７个，其中包含９个ｃｒｙ７Ａｂ基因。但是关于ｃｒｙ７ Ｘ－Ｇａｌ、ＩＰＴＧ、ＤＮＡｍａｒｋｅｒ、蛋白质分子量标准均购自ＴａＫａＲａ 类基因的杀虫活性却很少被报道，有研究发现，ｃｒｙ７类基因可 公司；质粒ＤＮＡ提取试剂盒、胶回收试剂盒购自美国Ａｘｙｇｅｎ 以编码对鞘翅目害虫有活性的蛋白；据相关的研究表明， 公司；引物由金维智生物工程（北京）有限公司合成；分析纯 ［２］ Ｃｒｙ７Ａｂ３蛋白对马铃薯甲虫有较高的杀虫活性 。Ｃｒｙ７Ａｂ４ 化学试剂均为市售。 蛋白胰蛋 白酶 （ｔｒｙｐｓｉｎ）酶解液对鞘翅 目的大猿叶甲 １．２　方法 （Ｃｏｌｏｐｈｅｌｌｕｓｂｏｗｒｉｎｇｉ）显示出一定的杀虫活性，但对鳞翅目的 １．２．１　土样来源及Ｂｔ菌株的分离　土样采自中国海南地 ［１０］ 小菜蛾（Ｐｌｕｔｅｌｌａｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ）、甜菜夜蛾（Ｓｐａｄｏｐｔｅｒａｅｘｉｇｕａ）、亚 区，采用温度法 进行Ｂｔ菌株的筛选。 洲玉米螟 （Ｏｓｔｒｉｎｉａｆｕｒｎａｃａｌｉｓ）、马铃薯 甲虫 （Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ １．２．２　Ｂｔ基因组的提取　分离纯化后的Ｂｔ菌株在固体 ＬＢ