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质粒DNA 的提取及酶切 实验原理 实验仪器 实验试剂 实验步骤 注意事项 实验原理 在pH 12.0 ~ 12.6碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。 限制性内切酶在一定的条件下对DNA特异序列进行切割。 实验仪器 1 ．恒温培养箱 2 ．恒温摇床 3 ．台式离心机，最高转速14000g 4 ．高压灭菌锅 5 ．水浴锅 6 ．电泳仪 7 ．电泳槽 实验试剂 1．溶液Ⅰ 2．溶液Ⅱ 3．溶液Ⅲ 4．结合缓冲液 5．浓缩漂洗液 6．洗脱缓冲液 7．离心吸附柱 8．废液收集管 实验步骤 （一）提取质粒 1. 将2 mL 含Amp ( 50 μg／mL ）的LB 液体培养基加入到试管中，接人上述的含pTOPⅡ 质粒 的大肠杆菌，37 ℃ 振荡培养过夜。 2 ．取1.5 mL 培养物倒人微量离心管中,1200rpm/min 离心 1 min 3 ．吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。 4 ．将细菌沉淀悬浮于100μL 溶液I中，充分混匀，vertex。 5 ．加150μL 溶液Ⅱ，立即温和颠倒离心管数次，使菌体充分裂解，裂解后的菌体变的清凉。随 后将离心管放置冰上1-2min(时间勿超！) 6. 加人150μL溶液Ⅲ，立即温和颠倒离心管数次，将离心管室温放置5 min 。12000rpm离心 12min。 7. 将420μL结合缓冲液加入离心吸附柱中，然后将步骤3中的上清加入离心吸附柱中（尽量去除 杂质），混匀，12000rpm离心30s。倒掉废液收集管中的废液。 8. 加入750μL漂洗液于离心吸附柱中，静置1min后，12000rpm离心15s。倒掉废液收集管中的 废 液。重复一次。倒掉废液后。再次于1200rpm/min 离心 2 min，尽量除去漂洗液。 9． 小心取出离心吸附柱，将其套入一个干净的1.5ml Eppendorf 离心管中，加入50μL无菌水， 室温放置2-5min后，1200rpm/min 离心 1 min。 -20 ℃ 保存。 （二）酶切 酶切反应体系（20μL）: ddH2O 16μL 10×Buffer R 2μL HindⅢ 1μL 质粒 1μL Total 20μL 37℃ 保温2h ，凝胶电泳观察实验结果 注意事项 质粒检测： 电泳检测：质粒电泳一般有三条带，分别为质粒的超螺旋、开环、线型三种构型。 吸光值检测：采用分光光度计检测260nm、280nm波长吸光值，若吸光值260nm/280nm的比值介于1.7－1.9之间，说明质粒质量较好，1.8为最佳，低于1.8说明有蛋白质污染，大于1.8说明有RNA污染。 * * 内蒙古农业大学生物化学与分子生物学实验教学中心 制作人：李国婧