第2章细胞培养技术与应用2.ppt

蚌科 三角帆蚌 （珠质细腻、光滑、色泽鲜艳、较圆，质量最佳，但成珠慢） 褶纹冠蚌 （珍珠长圆形，白色或粉红色；成珠快，产量高） 一、电子显微镜检测技术 研究病毒形态、鉴定 诊断病毒病 检测不能在体外培养的病毒，如轮状病毒、星状病毒、嵌杯病毒、HAV等都是用电镜最先发现的——能进一步发现新的病毒和病毒病。 1、正染法（超薄切片法、病组织） 将细胞用戊二醛固定，然后脱水、包埋、切片、染色、观察病毒颗粒，通常1~2 d完成。 操作复杂、费时，但样品可长期保存，可观察病毒粒子形态与发生过程。 2、负染法 直接将病毒悬液(也可用细胞)滴在铜网上，用重金属(通常用磷钨酸) 进行染色，观察病毒颗粒，10-20min可出结果。 原理：负性染料不渗入病毒颗粒，而是将病毒颗粒包绕，由于负性染料含重金属使电子束不能穿透，病毒颗粒具有亮度，在周围暗背景上显示亮区——较正染法显示的图像清晰，可显示病毒的结构。 缺点：敏感性低，要求病毒量在107／mL以上，同科病毒难于鉴别。 3、投影技术 二、病毒的免疫检测 主要试剂: 酶标记的抗体或抗原 酶标物特点： 免疫学活性 酶对底物的催化活性 三个部分： 免疫反应 酶与底物反应 检测方法的建立 （一）固相载体 聚苯乙烯 特点：吸附蛋白能力强，保留其免疫活性 形状：小试管、小珠、微量ELISA板 （二）抗原和抗体 高纯度的抗原 高效价的抗体 （三）酶和底物的选择 标记酶的要求： 活性高 性质稳定 专一性强 酶催化底物的显色信号易于判断和测量 方法敏感，重复性好，简单易行 酶的底物易于配制保存，酶及底物价廉 Southern 杂交的主要步骤 待测DNA样品的制备、酶切 待测DNA 样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳 凝胶中DNA的变性：碱变性 Southern转膜： 硝酸纤维素(NC)膜、尼龙膜 毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法 探针的制备 Southern杂交 杂交结果的检测 什么是疫苗？ 疫苗是将病原微生物如细菌、病毒等及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或转基因等方法制成的用于预防传染病的自动免疫制剂。 疫苗刺激机体免疫系统对某种病原微生物处于高度戒备状态 疫苗的发展历史 ①古典疫苗时期：牛痘苗、狂犬病疫苗 ②培养疫苗时期：脊髓灰质炎疫苗、卡介苗 ③基因工程疫苗时期：乙型肝炎基因工程疫苗 疫苗的种类 灭活疫苗 弱毒疫苗 基因工程疫苗 重组亚单位疫苗 DNA疫苗 基因缺失疫苗 基因突变疫苗 活载体疫苗 传统疫苗 成本低、无致病性、适用广 灭活疫苗（inactivated vaccine）：又称死疫苗，是用化学或物理的方法，将具有感染性的完整的病原微生物杀死，使其失去传染性而保留抗原性而成。 一、灭活疫苗 百日咳、乙型脑炎、流行性脑脊髓膜炎、狂犬病、伤寒、钩体病、甲型肝炎、鼠疫、流感、脊髓灰质炎等疫苗。 二、减毒活疫苗（弱毒疫苗） 减毒活疫苗（live-attenuated vaccine）：用人工诱变或从自然界筛选出的毒力高度降低或无毒的活的病原微生物制成的疫苗。可模拟自然发生隐性感染，诱发理想的免疫应答而又不产生临床症状。 脊髓灰质炎、结核病、麻疹、风疹疫苗、腮腺炎等疫苗。 ● 优点：能诱发全面、稳定、持久的体液、细胞和粘膜免疫应答；一般只须接种一次；可采用口服、喷鼻或气雾途径免疫。 ● 缺点：有效期短和热稳定性差，运输、保存条件要求较高；回复突变危险；使用范围相对窄。 减毒活疫苗优缺点 1、基因缺失活疫苗（gene deleted live vaccine）：采用分子生物学技术，去除与毒力或毒力相关基因片段，使病原微生物毒力减低或丧失。用缺失突变毒株制成的疫苗。 与自然突变株（多为点突变毒株）相比，基因缺失活疫苗具有突变性状明确、稳定、不易发生毒力返祖的优点。 三、基因工程疫苗 对于某些抗原性弱、易发生免疫逃避的病原体，常规疫苗往往难以获得有效的免疫应答及保护性。 2、亚单位疫苗 对于一些免疫保护机制不清、可能诱导免疫病理反应、有潜在致肿瘤作用的病毒，以及不易培养的病原体，则难以