纳米成像样品制备、数据采集..PDFVIP

纳米成像样品制备、数据采集 及处理 黄万霞 2013.11.21 同步辐射纳米分辨CT系统 常用能量8keV 大视场模式：视场60um60um，分辨率100nm 高分辨模式：视场15um 15um，分辨率50nm 样品尺寸60um 以内，样品处理非常重要！！ 样品处理 样品制备之一：粘在针尖上  大视场成像  样品：尺寸2060um，颗粒状（球状或条状）  工具：大头针、环氧树脂AB胶、显微镜 FIB 聚焦离子束刻蚀处理样品 1. FIB milling 2. Lift-out 激光切割处理样品  Stage1: 从大样品中切割出约600um圆柱，需20min；  Stage2: 激光切割，需20min，加工完的样品直径60100um。 Oxford Laser Micro-Machining Systems Double Workstation Sample Preparation System Model A-532DW 样品制备之二：吸附在膜上  高分辨成像  样品：尺寸515um，颗粒状、粉末状、细胞  工具：聚酰亚胺薄膜（25um，50um）、移液器（0.5-10ul）及枪头、 超声波清洗机  操作简单  缺点：不能-9090º采集，稳定性较差。 使用氮化硅薄膜窗  框架5mm5mm，窗口2mm2mm，膜厚200nm 框架7.5mm7.5mm，窗口2.5mm2.5mm，膜厚200nm  优点：比聚酰亚胺薄膜稳定性好  缺点：粘金颗粒时可能捅破SiN窗 样品制备之三：细胞制备  将聚酰亚胺薄膜浸泡于纯水中，超声清洗10min,再用纯水洗涤两次；  放于培养台晾干，照射紫外线1h消毒；  细胞接种和培养；  药物处理后，用常温的PBS(磷酸缓冲液)洗涤细胞2-3次(注意：固定前观 察细胞，贴壁密度控制在30%以下，细胞之间不要紧挨着)；  70%冰冷乙醇固定细胞30min；  重金属染色10-15min(0.1%-0.5%醋酸铀染色，或0.2%-1%的磷钨酸盐： 盐的浓度根据细胞来调节)，用PBS洗涤1-2次；  50%，70%，80%，90%，100%，100%浓度酒精分别脱水，每次脱水10min；  空气中干燥。 数据采集 实验调节过程 Step1 在预准直系统中找到并挑选样品 Z Y X 低倍 高倍 低倍镜头(10X)下调节样品XYZ 记下预准直系统样品的坐标值 切换到高倍镜头(50X)下调节 使样品位于屏幕中心 Step2 在样品上粘标记物（金颗粒）  准备一根纤维将其固定在一根细长木片的末端，在纤维上粘上金颗粒 （3um ），固定在预准直显微镜的操作平台上。  移动操作平台的XYZ轴将纤维调节到显微镜视场中  小心地慢慢地移动纤维去碰触样品，将金颗粒粘在样品上。 Step3 将样品放入纳米分辨成像设备中，样品坐标设 成和预准直系统一致，样品转角转到-60度。 Step4 利用可见光显微镜VLM观察样品并将样品粗调至转轴上。  切换到VLM （Secondary Camera ）观察样品；  点击连续采集；  显示黄色十字中心线；  调节样品X轴和Y轴至视场中心； 调节样品转轴  旋转样品到30º和-150º （样品零点在