HisTag_融合蛋白纯化(默克新版).pdf

产品使用说明书 His ·Tag 融合蛋白纯化操作手册 采用pET 系统进行原核蛋白表达，蛋白的表达量达到20mg/100ml 培养物并不是困难的事。 在大肠杆菌中表达的目的蛋白，其可溶性（可溶蛋白或包涵体）、细胞定位（细胞质、细胞周 质、培养基上清），都会对后续的纯化策略造成影响。我们建议研究者在蛋白表达后，首先进 行目的蛋白的细胞定位（请参考pET 系统操作手册）；在进行大量纯化之前，小量纯化蛋 白，摸索确定适合于具体蛋白的纯化条件，也是值得推荐的好方法。外源蛋白在大肠杆菌中表 达，可能以可溶形式存在，也可能以包涵体形式存在。尤其在高水平表达的条件下，更容易形 成包涵体。包涵体的形成与外源蛋白本身性质、载体、宿主菌、以及表达水平都有关系，可以 通过选择不同表达载体和E.coli 宿主菌组合，摸索生长条件和适宜诱导条件，达到优化蛋白表 达的目的。His·Tag®融合蛋白，可以在天然条件或变性条件下用NTA His·Bind 树脂或IDA His·Bind 树脂进行纯化。 内容提要 一、亲和纯化样品的前处理 1. 菌液体积-起始目的蛋白量 2. 细菌裂解获得可溶蛋白 • BugBuster Master Mix 蛋白抽提方法 • 机械破碎（如超声等） 二、亲和纯化步骤 Ni-NTA 树脂纯化 1. Ni-NTA 树脂的兼容性 2. 天然条件纯化 • 柱层析 • FPLC • 批次小量纯化 3. 变性条件的纯化 • 柱层析 • FPLC 纯化 • 批次小量纯化 4. 树脂再生 5. 常见问题与改善建议 附录：补充背景知识 • NTA 和IDA 化学基团 • 杂蛋白 • His·Bind 基质选择指南 • 如何降低非特异性结合 • 在确定裂解方法前的考虑 • 漂洗杂蛋白 • 蛋白可溶性及细胞定位 • 目的蛋白的洗脱 • 天然或变性条件下目的蛋白的纯化 • 纯化真核表达体系来源的His·Tag 融合蛋白 • 批次小量纯化或柱层析纯化方法 • His·Tag 融合标签的去除 • 目的蛋白的结合 • 推荐资料 默克生命科学服务热线：400 820 8872 bioteam@ 一、亲和纯化样品的前处理 1. 菌液体积-起始目的蛋白量 纯化条件的优化需考虑多个因素，包括His·Tag 融合蛋白表达水平和上样量。若目的蛋白未能高效表达，需要采 用一个较高的浓缩系数（concentration factor ）进行菌的裂解，即在较大培养体系中，按一定比例加入一定体积 的裂解/结合缓冲液。浓缩系数定义为菌液体积与裂解/结合缓冲液体积之比。不同目的蛋白表达水平推荐使用的 裂解/结合缓冲液体积、对应的浓缩系数大小，请参考表1。 例如，某蛋白表达水平约为0.1mg/ml，需要在变性条件下进行小批提纯，则100ml 的培养物离心获得的菌体， 按浓缩100 倍比例重悬于含变性剂的1ml 裂解/结合缓冲液中。 在非变性条件下进行纯化时，要准确预计裂解液中可溶蛋白的含量比较困难，一般建议采用50-100 倍浓缩。 表1 确定所需菌液体积 His·Tag 融合蛋白浓度 表达水平 培养体积 His·Tag 融合 浓缩系数 蛋白总量 （在1ml 溶液中裂解后） 变性条件 50mg/L 40% 3ml 150µg 3 × 10mg/L 8% 10ml 100µg 10× 2mg/ L 1.6% 25ml 50µg 25 × 0.5mg/ L 0.4% 50ml 25µg 50 × 0.