Western Blot技术及实例解析.pdf

蛋白穿越重现之旅 ——Western Blot技术  Western Blot 的起源和应用及原理  Western Blot实验流程详解  Western Blot实验中的常见问题分析  Western Blot 的起源、应用及原理  Western Blot实验流程详解  Western Blot实验中的常见问题分析 Western Blot起源  Renart, J., J. Reiser, G. R. Stark, (1979). Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure. Proc Natl Acad Sci U S A 76(7): 3116-20.  DNA杂交技术，Southern Blot  RNA杂交技术，Northern Blot  蛋白质印迹技术，Western Blot Western Blot的应用  定性或半定量分析目的蛋白的特异性表达  蛋白-蛋白、蛋白-DNA和蛋白-RNA相互作用的后续 分析  蛋白修饰的鉴定（磷酸化、糖基化的鉴定） Western Blot实验原理  直接法  间接法  Western Blot 的起源和应用  Western Blot实验流程详解  Western Blot实验中的常见问题分析 Weatern Blot实验流程 样品制备及定量 SDS转膜 抗体杂交 封闭 显色发光  Western Blot 的起源和应用  Western Blot实验流程详解  样品制备及定量  SDS电泳  转膜  封闭  抗体杂交  显色  Western Blot实验中的常见问题分析 样品制备  总体原则  整个提取过程在低温下进行，保持蛋白处于溶解状态， 防止蛋白变性、降解与修饰。  根据实验目的选取不同抽提液和抽提方法。 有时需要去除体系中的核酸、无关蛋白等干扰成分  方法简便，耗时短，易于操作。  制备好的样品若不立即使用，需分装冻存于-80℃冰箱， 及防止储存过程中降解。 样品制备方法简介  培养细胞的裂解  组织细胞的裂解 弃细胞培养基 冰上分离目的组织 1×PBS洗涤 液氮研磨 加入细胞裂解液 加入细胞裂解液 冰上裂解细胞 冰上裂解组织细胞 离心收集上清 离心收集上清 细胞裂解液 组分 作用 举例 提供一定pH范围的缓冲体系，使蛋白保持稳 Tris-HCl （pH7.5） 缓冲液 定，增