P物质受体拮抗剂对急性坏死性胰腺炎时肺损伤保护作用实验探究.docVIP

P物质受体拮抗剂对急性坏死性胰腺炎时肺损伤保护作用实验探究 　; 作者：胡浩霖，石欣，霍明东，高乃荣，范健 ;【摘要】; 目的:探讨神经激肽?1受体(NK?1R) 拮抗剂对急性坏死性胰腺炎(ANP)大鼠肺损伤的作用，了解ANP时阻断该受体对肺损害是否具有保护作用。方法:90只健康成年SD大鼠随机分为正常对照组、ANP组和拮抗剂组各30只。正常对照组开腹后只翻动胰腺，ANP组和拮抗剂组胆胰管恒速逆行注射5%牛磺胆酸钠，制成ANP大鼠模型。拮抗剂组在制模成功后经尾静脉注射NK?1R拮抗剂spantide(0.001 25%) 0.5 ml。检测不同时间点肺髓过氧化物酶(MPO)活性和肺毛细血管通透性(LCP)的变化。应用免疫组织化学方法进行NK?1R的组织学定位。结果:ANP组6h后肺组织MPO活性和LCP即明显高于正常对照组，并且持续升高（Plt;0.01）。与正常对照组的各个时间点相比，拮抗剂组肺组织MPO活性和LCP没有明显变化（Pgt;0.05）。免疫组化检查显示，NK?1R的表达主要位于肺泡隔血管内皮细胞表面及部分肺泡Ⅰ、Ⅱ型上皮细胞表面等处。结论:ANP 时，P物质通过与NK?1R结合发挥作用，NK?1R拮抗剂阻断了P物质的作用路径，对ANP肺损伤起到一定的治疗作用。 【关键词】; 急性坏死性胰腺炎；神经激肽?1受体；神经激肽?1受体拮抗剂；肺损伤；大鼠 　急性坏死性胰腺炎（ANP）是外科重危急症之一，病理演变迅速，病情险恶。ANP时最易受损的靶器官是肺，50%~70%的急性胰腺炎病人肺功能受损，部分发展为急性呼吸窘迫综合征(ARDS) [1]。因此，防治肺损伤对提高ANP疗效有着重要的意义。ANP并发肺损伤的发病机制尚未完全清楚。近来的研究表明，P物质在炎性疾病中起到重要的作用[2?3]。 P物质与3种G蛋白偶联的神经激肽受体结合，分别为神经激肽?1受体(NK?1R)、神经激肽?2受体(NK?2R)和神经激肽?3受体(NK?3R)。我们以往的研究表明，ANP时肺组织中NK?1R的表达水平明显上调，扰乱了神经激肽的作用环节，加剧了ANP 时的肺损害[4]。本研究通过制作ANP模型，予NK?1R拮抗剂干预，探讨NK?1R拮抗剂在ANP肺损伤发病机制中的作用，为ANP肺损伤的防治提供一条可能的途径。 　　1; 材料和方法 　　1.1; ANP模型制作健康成年SD大鼠90只，体重250～280 g。实验前大鼠禁食12～16h，不禁水。2%戊巴比妥钠0.01 ml·kg－１腹腔注射麻醉。60只大鼠采用胆胰管内逆行注射5%牛磺胆酸钠(0.1 ml·kg－１)建立ANP模型。正常对照组（30只）仅将十二指肠提出切口，轻轻翻动胰腺3次，不注射牛磺胆酸钠，余操作步骤与下述ANP组相同。将已成功制备的ANP模型大鼠随机分为以下两组：（1）ANP组(30只)，制模成功后经尾静脉注射0?9%生理盐水0.5 ml；（2）拮抗剂组(30只)，制模成功后经尾静脉注射NK?1R拮抗剂0.001 25% spantide (Sigma 公司) 0.5 ml。分别于6、12和24h处死大鼠(各10只)，留取部分肺脏、胰腺和门静脉血标本，立即切成块状并投入液氮，保存于－80℃超低温冰箱中，或经福尔马林固定后脱水包埋、常规切片。 　　1.2; 淀粉酶和肺髓过氧化物酶(MPO)活性的测定血液分离血浆后进行淀粉酶检查(碘淀粉比色法)。肺组织匀浆后超声粉碎成亚细胞成分，肺组织MPO活性测定按照MPO检测试剂盒(Sigma公司)进行。 　　1.3; 肺毛细血管通透性(LCP)的测定采用伊文思蓝浸入法测定各组大鼠的LCP。经尾静脉穿刺注入2%伊文思蓝（1 ml·kg－１），15 min后处死动物，剖胸后由右心室匀速注入10 ml生理盐水冲洗血管内染料，取出肺脏，将肺表面水分吸尽后，于电子天平上称取湿重，放入4 ml甲酰胺中，于37℃温箱放置24h，提取组织中染料。过滤后染液用分光光度计于620 nm处读取OD值，通过标准曲线计算提取出的染料量，以单位组织中染料提取量反映LCP。伊文思蓝标准曲线的建立方法：分别取0.1%伊文思蓝标准品0、5、15、20、30、40mu;l，加入4 ml甲酰胺中，620 nm比色，将数据进行回归分析，得到回归方程：OD=0.011x-0.001，r=0.99。 　　1.4; 免疫组织化学检测分析石蜡切片经过脱蜡至水后，浸泡在TBS缓冲液（10 mmol·L－1 Tris?HCl,0.85% NaCl，0.1% Triton?X?100，pH 7.4）中15 min，用稀释度1∶200的羊抗大鼠NK?1R多克隆抗体（Santa Cruz公司）于4℃湿盒内孵育过夜，二抗为兔抗羊IgG（美国Kirdegarrd amp; Perry Lab