Stat5反义寡核苷酸联合Jak激酶抑制剂AG490调控结肠癌细胞增殖及.doc

Stat5反义寡核苷酸联合Jak激酶抑制剂AG490调控结肠癌细胞增殖及 　【摘要】 目的 探讨Stat5反义寡核苷酸（Stat5 ASON）联合Jak激酶抑制剂（AG490）治疗结肠癌的作用机制。方法 应用Stat5 ASON与AG490处理结肠癌细胞HT29，Western blot检测Stat5、pStat5、cyclin D1与BclxL表达，MTT法检测细胞增殖状态，流式细胞技术检测细胞周期与凋亡。结果 Stat5 ASON与AG490作用于HT29细胞72h后，G1期细胞比率由72.7%上升至87.2%，S期细胞比率分别由19.6%，下降至7.5%，凋亡细胞百分比由8.7%增加至24.2%。Stat5 ASON与AG490可以抑制结肠癌细胞增殖，促进结肠癌细胞凋亡，联合应用Stat5 ASON与AG490可以起协同作用，明显抑制结肠癌细胞Stat5信号转导通路活化。结论 选择性阻断细胞内信号转导通路可能为治疗结肠癌提供新途径。 【关键词】 结肠癌 信号转导 增殖 脱嗜作用 　　0 引言 　　研究显示，细胞内信号转导通路异常激活与多种肿瘤的发生、发展密切相关[1]。本研究应用Stat5反义寡核苷酸与Jak激酶抑制剂AG490处理结肠癌细胞，观察对结肠癌细胞增殖和凋亡的影响，探讨以Stat5信号转导通路为靶点在药物治疗结肠癌中的作用。 　　1 材料与方法 　　1.1 细胞培养 　　人结肠癌细胞HT29，培养于含有10%胎牛血清（美国HyClone公司）的RPMI1640培养基（美国GIBCOL/BRL公司）。JAK激酶抑制剂AG490（美国Calbiochem公司）。 　　1.2 Stat5寡核苷酸的合成与纯化 　　Stat5反义寡核苷酸根据Stat5翻译起始点合成，同时本研究还设立了正义寡核苷酸链和错配寡核苷酸链作为对照组，错配链的序列在GenBank数据库进行同源性检索，未发现同源序列。（1）Stat5反义寡核苷酸序列：5CCA CAC AGC CAT GTT TAC CCG3’；（2）Stat5正义寡核苷酸序列：5CGG GTA AAC ATG GCT GTG TGG3’；（3）Stat5错配寡核苷酸序列：5CCA CAG AGC CAT GTT TTC CCG3’。以上寡核苷酸由（美国Santa Cruz公司）合成及纯化。 　　1.3 阳离子脂质体转染核苷酸 　　LipofectAmine2000 （美国GIBCOL/BRL公司），转染过程参照GIBCOL/BRL公司手册。 　　1.4 细胞增殖状态检测（MTT法） 　　接种细胞于96孔板，贴壁后，无血清培养细胞16～24h，使细胞同步化。研究分为4组：（1）对照组；（2）AG490组；（3）Stat5 ASON组；（4）Stat5 ASON+AG490组。每个研究点设置3组平行对照，重复3次实验取平均值。空白对照组加无血清培养基，AG490组、Stat5 ASON组与Stat5 ASON+AG490组分别加入AG490与Stat5 ASON，第0、24、48、72h分别加入MTT 5mg/ml （美国Sigma公司），继续培养4h，每孔加入DMSO 200μl，酶标仪测定540nm吸收值，绘制生长曲线。 　　1.5 细胞周期检测 　　无血清培养细胞16～24h，使同步化，分组同上，第0、24、48、72h分别消化细胞，0.5ml PBS重悬细胞，70%冰乙醇固定细胞过夜，加入RNAase A至终浓度50μg/ml，37℃恒温水浴1h，加入PI（美国Sigma公司）至终浓度50μg/ml，4℃避光染色1h，上流式细胞仪FACScan（美国BectonDickinson公司）检测，资料用Cell Quest细胞周期分析软件处理。 　　1.6 细胞总蛋白、胞浆蛋白与核蛋白提取 　　1.6.1 细胞核蛋白提取 收集细胞悬液；用低渗缓冲液于冰上裂解细胞10min；4℃条件下13 000r/min离心1min；4℃条件下用高盐缓冲液重悬粗提的细胞核，振荡30min；4℃条件下13 000r/min离心10min；取上清为核提取物，贮存于-80℃于2个月内用完。 　　1.6.2 总蛋白提取 参照Santa Cruz公司蛋白提取方法，应用RIPA缓冲液裂解结肠癌细胞得到总蛋白。 　　1.6.3 蛋白浓度测定方法（Bradford法） 以牛血清蛋白（BSA）作为标准品，根据蛋白定量试剂盒（美国BioRad公司）说明绘制蛋白定量标准曲线，于分光光度计595nm下测光密度值，计算提取液蛋白浓度。 　　1.7 Western blot 　　细胞蛋白样品50μg上样于7.5%的聚丙烯酰胺凝胶经电泳分离后，电转移至P