八高效液相色谱法及临界流体色谱法.docVIP

第八章 高效液相色谱法及临界流体色谱法 基本要求： 1. 了解高效液相色谱法的优点及适用范围 2. 理解常用检测器的原理、优缺点及适用范围 3. 理解各种分离方式的原理及适用的分析对象及选择原则 4. 理解超临界流体色谱法的原理、优缺点及适用范围 高效液相色谱法是一种以液体为流动相的现代柱色谱分离分析方法。它是在经典液相色谱的基础上，引入气相色谱的理论和技术而发展起来的，因此气相色谱的许多理论与技术同样适用于高效液相色谱。 高效液相色谱法与气相色谱法的主要差别在于流动相和操作条件。在气相色谱中，流动相是惰性的气体，分离主要取决于组分分子与固定相之间的作用力，而在高效液相色谱中，流动相与组分之间有一定亲和力，分离过程的实现是组分、流动相和固定相三者间相互作用的结果，分离不但取决于组分和固定相的性质，还与流动相的性质密切相关。高效液相色谱一般可在室温下进行。由于采用颗粒极细的固定相，柱内压降很大，加上流动相粘度高，必须采用高入口压，以维持一定的流动相线速。 高效液相色谱法与经典液相色谱法的主要差别在于固定相的性质和粒度等。高效液相色谱所用固定相颗粒细而规则，孔浅，能承受高压，加上使用高压输液设备和高灵敏度的检测器，其分离效率、分析速度和灵敏度都远远高于经典液相色谱法。 原则上，只要能溶解在流动相中的物质都可以用高效液相色谱分析，尤其适合那些不宜用气相色谱分析的难挥发性物质、热不稳定性物质、离子型物质和生物大分子等。在目前已知的有机化合物中，有80%的有机化合物能用高效液相色谱法分析。由于此法不破坏样品，因此可方便地制备纯样。 8．1 固定相和流动相 8.1.1 固定相 高效液相色谱固定相按承受的高压能力可分为刚性固体和硬胶两大类。刚性固体以二氧化硅为基质，它可以承受较高的压力，若在它的表面键合各种功能团，其应用更广泛。硬胶由聚苯乙烯与二乙烯基苯交联而成，承受压力较低，主要用于离子交换和尺寸排阻色谱。 固定相按孔隙深度可分为表面多孔型和全多孔微粒型两大类，如图8—1所示。表面多孔型是在实心玻璃外面覆盖一层多孔活性物质，如硅胶、氧化铝、离子交换剂和聚酰胺等，其厚度为1-2μm，以形成无数向外开放的浅孔。全多孔微粒型由直径为10-3μm数量级的硅胶微粒凝聚而成。 图8-1 高效液相色谱固定相类型 (a) 表面多孔型; (b) 全多孔微粒型 表面多孔型固定相的多孔层厚度小、孔浅、相对死体积小，出峰快，柱效高。但因多孔层厚度小，最大允许进样量受限制。 全多孔微粒型固定相颗粒细，孔仍然浅，因此传质速率仍很快，柱效高，但需更高的操作压力。最大允许进样量比表面多孔型大5倍。因此，通常采用此类固定相。 根据分离模式的不同而采用不同性质的固定相，如活性吸附剂、键合有不同极性分子功能团的化学键合相、离子交换剂和具有一定孔径范围的多孔材料，从而分别用作吸附色谱、键合相色谱、离子交换色谱及尺寸排阻色谱固定相,见表6—1。 8.1.2 流动相 高效液相色谱中，流动相对分离起着极其重要的作用，在固定相选定之后，流动相的选择是最关键的。不论采用哪一种色谱分离方式，对用作流动相的溶剂的要求是： (1) 纯度高 溶剂的纯度极大地影响色谱系统的正常操作和色谱分离效果。溶剂中若存在杂质会污染柱子，存在固体颗粒会损害高压泵或输液通道，使压力升高，基线漂移。 (2) 粘度低 高效液相色谱中为获得一定流速必须使用高压，若溶剂粘度较高，操作压力也更大。高的压力会使色谱柱性能降低，而且泵也容易损坏。 (3) 化学稳定性好 流动相不能与固定相或组分发生任何化学反应。 (4) 溶剂沸点要高于55℃ 低沸点溶剂挥发度大，容易使流动相浓度或组成发生变化，也容易产生气泡。 (5) 溶剂要能完全浸润固定相 溶剂对所测定的组分要有合适的极性，最好选择样品的溶剂作流动相，否则发生溶剂与流动相不相混溶的情况，使分离变坏。 (6) 溶剂要与检测器匹配 溶剂要适合于检测器，例如采用示差折光率检测器，必须选择折光率与样品有较大差别的溶剂作流动相；若采用紫外吸收检测器，所选择的溶剂在检测器的工作波长下不能有紫外吸收。 8．2 高效液相色谱仪 高效液相色谱仪主要由贮液器、脱气器、高压泵、进样器、色谱柱和检测器等组成。如果8-2所示。 图8-2 高效液相色谱仪示意图 8.2.1 贮液器 贮液器用于存放溶剂。溶剂必须很纯，贮液器材料要耐腐蚀，对溶剂呈惰性。通常采用1-2L的大容量玻璃瓶，也可用不锈钢制成。贮液器应配有溶剂过滤器，以防止流动相中的颗粒进入泵内。溶剂过滤器一般用耐腐蚀的镍合金制成，孔隙大小一般为2μm。 8.2.2 脱气装量 脱气的目的是为了防止流动相从高压柱内流出时，释放出气泡进入检测