第九课 全血改进线性指数聚合酶链式反应用于焦磷酸测序检测基因多态性.pdfVIP

第43 卷 分析化学 (FENXI HUAXUE)摇 研究报告 第1 期 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 2015 年1 月 Chinese Journal of Analytical Chemistry 55 ~62 DOI:10.11895/j.issn.0253鄄3820.140395 全血改进线性指数聚合酶链式反应用于 焦磷酸测序检测基因多态性 1 2 1 2 *1,2 1,2 项 铮摇 刘云龙摇 邢晓清摇 初亚男摇 宋沁馨 摇 周国华 1(药物质量与安全预警教育部重点实验室,中国药科大学,南京210009) 2(南京大学医学院附属金陵医院药理科,南京210002) 摘摇 要摇 焦磷酸测序是目前基因多态性检测的主要方法之一,但是其前期的样本制备工作较为繁琐,限制了 其在临床检测中的应用。 为了简化焦磷酸测序的流程,本研究根据不对称PCR原理,改进了线性指数聚合酶 链式反应(LATE鄄PCR)的引物设计方法,增加过量引物的长度和浓度,并结合全血直接扩增技术,建立了基于 普通rTaq聚合酶和高pH 缓冲液(HpH Buffer)的全血改进LATE鄄PCR(Improved LATE鄄PCR,imLATE鄄PCR)方 法。 考察了方法的最优扩增体系、血液抗凝剂对其影响以及全血模板量。 采用单管、一步法直接扩增出单链 测序模板,成功地对24例临床血样的乙醇脱氢酶基因多态性进行了检测,检测结果可用于指导临床个体化用 药。 24例样本的基因型分别为ADH1B位点AA纯合6例、AG杂合 14 例、GG纯合4 例;ADH1C位点GG纯 合20例、AG杂合4例、AA纯合0例。 关键词摇 全血直接扩增;线性指数聚合酶链式反应;焦磷酸测序;基因多态性;酒精代谢 1摇 引摇 言 随着基因组学及后基因组学的发展,人们意识到基因多态性在阐明疾病的发生和发展、毒物的易感 性与耐受性、疾病临床表现的多样性以及对药物治疗的反应上都起着重要作用,而单核苷酸多态性是目 前最受关注的一类多态性。 焦磷酸测序技术是通过核苷酸和单链模板结合后释放焦磷酸引发酶级联反应,促使荧光素发光并 [1~3] [4] [5] [6] 进行检测的一种核酸测序技术 ,用于基因多态性检测 、微生物分型 、基因甲基化检测 等领 [7] 域,尤其是在大规模DNA测序中 的应用,使测序技术发生了革命性变化。 但是目前焦测序的单链模 [8] 板制备主要采用固相微球法 ,该方法操作步骤繁琐且效率较低;使用生物素标记引物、链亲和素包被 微球增加了检测的成本;同时,单链制备过程中容易引起样品的交叉污染,以上不足极大地妨碍了焦测 [9] 序技术的临床应用 。 [10] 为了解决单链模板制备问题,可以采取不对称PCR直接产生单链产物 ,但常规不对称PCR方法 扩增单链的效率低,无法得到广泛使用。 线性指数 PCR(Linear鄄after鄄the exponential鄄polymerase chain [11] Rreaction,LATE鄄PCR) 在不对称PCR 的基础上,通过优化引物浓