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小鼠DsbA-L基因的转录调控机制研究 中文摘要 小鼠DsbA-L 基因的转录调控机制研究 中文摘要 第一部分 鉴定调控小鼠DsbA-L 基因表达的转录因子 目的： 二硫键氧化还原酶类似蛋白（DsbA-L ）是近年发现的一种与脂联素多聚体形成 有关的重要调节蛋白，它具有显著上调高分子量脂联素水平及增强胰岛素敏感性的作 用，并且能缓解由内质网应激诱导的脂联素水平下降。DsbA-L 转基因小鼠可抵抗高 脂饮食诱导的肥胖、胰岛素抵抗和脂肪肝。DsbA-L 在脂肪组织高度表达，表达量随 脂肪细胞的分化显著增加。DsbA-L 水平与肥胖呈负相关。目前对 DsbA-L 基因的转 录调控鲜有研究。本研究拟对小鼠 DsbA-L 基因启动子活性进行分析，探讨 DsbA-L 基 因启动子区及其相关转录因子对DsbAL 表达的作用和可能机制。 方法： 1. 构建DsbA-L基因全长启动子及5′或3′端系列缺失的荧光素酶报告基因表达质 粒，分别转染HEK293和3T3-L1细胞，通过双荧光素酶活性检测系统检测报告基因活 性，明确调控DsbA-L表达的重要启动子区域。结合生物信息学分析对DsbA-L基因转 录调控起关键作用的潜在顺式作用元件。 2. 针对潜在的顺式作用元件，构建DsbA-L基因突变体荧光素酶报告基因表达质 粒，双荧光素酶活性检测系统分析该作用元件对启动子活性的影响。 3. 电泳迁移率变动分析法（EMSA ）以及染色体免疫共沉淀（ChIP ）实验确认 顺式作用元件与相应转录因子的特异结合。 4. 通过RNA干扰和过表达Sp1分析其对DsbA-L基因启动子活性的影响。 5. 采用实时荧光定量PCR及EMSA实验分析脂肪细胞分化以及高脂饮食干预对 DsbA-L基因转录影响的可能机制。 结果： 1. DsbA-L 基因最小启动子位于转录起始位点上游-186 ~ -34 。 2. 内含子 1 的+391 ~ +432 区域存在一个潜在的转录因子 Sp1 结合位点。 EMSA I 中文摘要 小鼠DsbA-L基因的转录调控机制研究 和 ChIP 实验证实 Sp1 与该区域 DNA 之间存在特异性结合。过表达和 RNA 干扰实验 分析显示，Sp1 具有转录抑制作用。 3. 3T3-L1 脂肪细胞分化过程中，DsbA-L 转录水平显著升高；Sp1 的表达水平 降低，Sp1 与其位于 DsbA-L 基因内含子 1 区域的 DNA 结合能力降低。 4. 与对照组相比，高脂饮食诱导的肥胖小鼠脂肪组织 DsbA-L 基因转录水平显 著降低，Sp1 与其位于 DsbA-L 基因内含子 1 区域的 DNA 结合能力亦显著降低。 结论： 转录因子 Sp1 通过与 DsbA-L 基因内含子区域的作用元件相互作用负调 DsbA-L 基因的转录。 第二部分 白藜芦醇对DsbA-L 基因的调控作用及其机制 目的 ： 探讨白藜芦醇上调 DsbA-L 基因表达的作用机制。 方法 ： 1. 采用实时荧光定量 PCR 和 Western blot 的方法检测白藜芦醇对HepG2 细胞和 3T3-L1 细胞中 DsbA-L mRNA 和蛋白水平的影响。 2. 以荧光素酶报告基因实验分析白藜芦醇对DsbA-L 基因启动子活性的影响。 3. 用电泳迁移率变动分析法（EMSA ）检测白藜芦醇对转录因子 Sp1 与 DsbA-L 基因内含子区 DNA 结合的影响。 4. 用 Western blot 方法检测白藜芦醇对 Sp1 蛋白表达的影响。 结果： 1. 在 HepG2 细胞和 3T3-L1 细胞中，白藜芦醇能够上调 DsbA-L mRNA 和蛋白 的表达水平。 2. 白藜芦醇可以显著增加DsbA-L 基因启动子报告基因质粒p(-186 to +432)Luc 的荧光素酶活性，而对缺失 Sp1 结合位点的报告基因质粒 p(-186 to +432)Lucmut 和