定量PCR实验设计和流程.pdf

Module 2: 定量PCR实验设计和流程 The world leader in serving science 1 定量PCR的实验设计 •准确定量样品的三个基本要求 •定量PCR的实验要素 •定量PCR的实验中的误差校正 2 准确定量样品的三个基本要求 •重复性好 •准确度高 •动力学范围宽 3 1. 重复性: 曲线一致性 重复性好 40个相同样本重复 4 2. 准确度 与正确检测数据的接近程度 5 3.动力学范围 能得到高质量数据的线性范围 (范围越大越好) 6 定量PCR的实验要素  目的基因 样品  标准曲线 标准品  监控系统 阳性对照  监控污染 阴性对照 7 目的基因: 样品 模板质量：纯度和浓度 分光光度计检测： – DNA纯度：OD260/OD280=1.8 – RNA纯度：OD260/OD280=2.0 Qubit® 荧光定量： – 分别定量DNA、RNA及蛋白质 – 准确性、灵敏度和简便性 – Qubit® Assay (dsDNA, ssDNA, RNA, protein) 8 标准曲线:标准品  目的：生成标准曲线，建立Ct值与浓度之间的线性关系  要求： – 绝对定量实验：标准品浓度已知 – 相对定量实验：标准品与待测样品的PCR效率一致，且接近 100% • 试剂质量一致：模板纯度、引物和探针的Tm值、酶活性、缓 冲液成分 • 反应条件一致：循环参数相同 9 标准曲线:如何制备标准曲线 •Don’t: •制备3个点的2倍标准曲线 •Do: •推荐制备至少5个点的10倍标准曲线 (4 logs) 10 标准曲线:标准品梯度稀释方法  10倍连续梯度稀释方法