超分辨显微成像技术的新发展.PDFVIP

超分辨显微成像技术的新发展 马 利 红 引 言 人类获得信息的主要器官是眼睛，然而靠人眼观察客观事物的空间分辨率的极限约 为3´10-4 米，客观世界中人眼不能分辨的所有细微结构称为微观世界。显微成像技术将 微观过程或结构成放大图像，以便于人眼能够直接观察。研究微观世界所涉及的学科领 域十分广泛，有生物、医学、材料科学、精密机械、微电子学、分子及原子物理、核物 理等等，微观世界中细分的微量尺度原则上是无穷的，因而显微学是跨多学科的，其发 展也是无止境的。 1665 年，Robert Hooke 用原始显微镜发现了池塘水中单细胞有机体，它的出现为人 类打开了微观世界的大门。光学显微镜由此成为历代生物学家的主要研究工具之一。生 物学家把显微镜作为一种主要工具来研究生物器官、组织和细胞，由此奠定了细胞学和 组织学的基础，并对生物学、遗传学、微生物学、病理学和医学的发展起到了极大的推 动作用。但传统光学显微镜有以下两个主要缺点：(1)受衍射极限的限制，其分辨率与照 明波长是同一个数量级，具有一个数值孔径(NA=nsin(q )) 的传统光学显微镜，分辨极限 为0.61l / NA ，称之为瑞利判据；(2) 由于使用的是场光源，观测到的是一个宽视野图像， 从而降低了信噪比，影响了图像的清晰度和分辨率。随着生物医学、材料科学等的发展 对显微提出了更高的要求，不仅希望其具有更高的分辨率，而且能对样品进行无损成像， 甚至希望可观察其三维图像。因此，传统的显微镜已不能满足要求。 电子显微镜的分辨率虽然远高于光学显微镜，但它需要在真空条件下工作，因此很 难观察活的生物样品，另外电子束的照射也会使生物样品受到辐照损伤。电子显微镜、 的局限以及高分辨显微的需求，迫使人们转向超经典衍射极限的光学超分辨理论和技术 研究，利用新原理、新技术、新方法来实现光学高分辨力成像和检测。 第一节 基于传统的 Rayleigh 分辨率意义下的超分辨理论 光学系统的空间分辨率是一个非常有用的概念，但是关于它的具体定义和描述却有 许多不同的见解。所有的经典分辨率标准都是针对等强度的两个点而言的。最著名也是 最广泛的绝对经典分辩率标准为 Rayleigh 标准[1]。按照 Rayleigh 标准，两个等强度点恰 好被分辨的条件是一个点的衍射斑的最大值与另一点的衍射斑的第一零值重合。因此， Rayleigh 标准下的分辩率极限由光学系统的强度点扩散函数的主瓣峰值点到第一零值点 的距离所决定。Rayleigh 分辩率标准是以人眼视觉的分辨能力为参考依据的，它还可以 推广到光学系统的点扩散函数主瓣附近无零点响应点的情形。在这种情形下，Rayleigh 标准定义当两点衍射斑合成强度的中央凹陷拥有中心峰值 81%强度时两个点扩散函数主 瓣峰之间的距离为光学系统的分辨极限。 其它被沿用的分辨率标准包括 Buxton[2]标准，Houston[3]标准，以及 Schuster4]标准 等等。Buxton 标准将合成衍射分布时两主瓣峰值间距与单点衍射半强度恰好相等作为极 限标准，Houston 标准和 Buxton 标准类似，但前者基于衍射强度分布，后者基于衍射振 幅分布。Schuster 标准定义能分辨的两点之间的距离极限是衍射斑主瓣无重叠，这个标准 的分辨率极限是Rayleigh 分辨极限的两倍。 上述分辨率标准通常是针对横向分辨率而言的，但对于轴向分辨率同样适用。它们 均与系统点扩散函数主瓣尺度相关，因此只取决于光学系统的数值孔径和工作波长，而 与光源强度和探测器灵敏度无关。这些基于计算图像而言的分辨率标准有很大的缺陷， 它们没有将实际的合成光强可能对应多个点源的情况，以及探测图像与照明条件和探测 器之间的关系列入考滤范围。实际上，分辨率问题应该针对探测图像进行讨论，其极限 应取决于系统误差和随机误差所导致的探测图像与计算图像之间的差异。虽然如此，经 典分辩率作为一种约定，仍不失为评价成像系统质量的一个重要依据。光学超分辨成像 术涉及到的 “超分辨”也是指超越传统的 Rayleigh 分辨率。 超分辨光学系统就是超衍射极限光学系统，这一直是光学界长期追求的理论目标和 现代光学中高新技术研究的方向之一。其目的是用较小孔径的光学系统实现较大孔径光 学系统的功能，达到光学系统成像具有更精细和实现更加精密的探测，对超微细光刻， 超微细胞