猕猴成纤维细胞系地建立及电穿孔转染单体红色荧光蛋白条件地优化.doc

猕猴成纤维细胞系的建立及电穿孔转染单体红色荧光蛋白条件的优化 1、相关定义 1.1、基因工程亚单位疫苗佐剂的概念、种类、作用及应用现状 免疫佐剂指的是与抗原同时或者预先使用,能增强机体针对抗原的免疫应答能力, 或改变免疫反应类型的物质。佐剂最初发现于 1925 年,法国免疫学家兼兽医 Gaston Rammon 将木薯淀粉、金属盐类以及油和化脓性细菌等加入疫苗后,能特异性的增强 白喉、破伤风抗毒素的产生(Rammon et al.,1925),自此将这些能增强人体特异性 免疫反应、却又与特异性免疫原无关的物质被称为佐剂。 疫苗佐剂可以非特异性地以物理或化学方式与特异性抗原结合,又发机体产生长 期高效的针对特定抗原的特异性反应。佐剂的使用不仅能更大程度的提高机体的保护 能力,还能有效减少抗原用量,降低生产疫苗的成本。铝盐佐剂是目前普遍应用于人 类疫苗的佐剂。近些年来,随着基因亚单位疫苗、核算疫苗等新型疫苗的开发使用, 可适用于这些疫苗的新型佐剂也有了较大的发展。现在备受关注的新型佐剂主要有 CpG DNA 和细胞因子类佐剂、补体佐剂等。 免疫佐剂的作用机理包括:提高疫苗抗原的生物学和免疫学半衰期,促进抗原呈 递到抗原递呈细胞,促进抗原递呈细胞对抗原的加工和递呈,诱导免疫调节因子的产 生。 免疫佐剂依据其物理特性和作用机制可以分为五大类。第一类佐剂可以将抗原持 续缓慢释放,并将抗原限定在免疫接种位置,延长抗原对免疫系统暴露的时间,并增 强随后的免疫应答以及产生免疫记忆。新的微粒载体如目前较多用的乳酸-羟基乙酸共 聚物(PLG)便是这类佐剂。口服后可以在胃肠黏膜相关的淋巴组织诱导免疫应答的 部位吸收和储存,诱导有效免疫反应。第二类佐剂对于诱导体液免疫时 B 细胞表面免 疫球蛋白识别三维结构特别重要。脂质体和皂角苦衍生物便是这类佐剂。第三类佐剂 可以改变抗原的特性,选择性靶向于抗原呈递细胞,增强抗原的免疫应答活性,如 PLG 微粒、IS-COMS(胆固醇、磷脂和皂角苷复合物)、脂质体等。而肠毒素和霍乱毒素 是有效的黏膜免疫佐剂,许多活菌载体也被用于将抗原靶向于黏膜免疫系统,如减毒 疫苗株伤寒沙门菌 TY2la 和脊髓灰质炎病毒。第四类是诱导 CD8+CTL 的佐剂。 CD8+CTL 应答在抗细胞内病原,特别是病毒中起关键作用。两性分子佐剂能和细胞 膜相互作用,允许抗原内化入细胞胞浆,是很好的诱导 CD8+CTL 的候选佐剂。第五 类佐剂能改变细胞因子网络调控和共刺激分子的表达,以非抗原特异方式诱导 T 细胞 亚型。 免疫佐剂包括很多种,主要有盐类佐剂、油乳佐剂、微生物及微生物来源的佐剂、 10 天然来源的佐剂、化学合成物、各类分子佐剂等等。 盐类佐剂属于传统佐剂,主要 包括铝盐佐剂和磷酸钙等,以诱导体液免疫应答为主,主要刺激机体产生 Th2 型反应。 铝盐佐剂是含 Al3+的无机盐,目前生产中常用的是氢氧化铝胶,成本低廉、使用方便、 且基本无毒,是在临床中使用最为广泛的一种佐剂;磷酸钙佐剂与铝盐佐剂同属于盐 类佐剂,但是与铝盐佐剂相比其具有不产生 IgE 抗体的优点,降低了发生超敏反应的危 险。 油乳佐剂含有油和乳化剂,其发挥作用的机制是抗原包被于油相形成的微结构 之内,形成贮存库而使抗原缓慢释放,刺激机体产生免疫反应。油乳佐剂可分为油包 水乳剂和水包油乳剂两种。油包水乳剂是水的微滴,在持续的油相中通过表面稳定剂 使其稳定。油包水乳剂的代表乳剂为弗氏佐剂(Freundadjuvant,FA),弗氏佐剂可 分为弗氏完全佐剂(Freund complete adjuvant,FCA)和弗氏不完全佐剂(Freundin complete adjuvant,FIA)两种。水包油乳剂是油的微滴,在持续的水相中通过表面稳 定剂使其稳定。水包油乳剂主要以 MF59,白油 Span 佐剂和佐剂 65 为代表,其中以 MF59 的效果最好。 目前已经证明的有免疫佐剂活性的微生物有革兰氏阳性菌和革 兰氏阴性菌及其产物。天然来源的佐剂多是从植物中提取的有效成分,以及某些动 物来源的物质,主要包括三萜糖苷皂甙、多种中药多糖、蜂胶、免疫刺激复合物等。 本研究所用的免疫佐剂是核酸佐剂 CpG,以下是对其的详细介绍: 核酸佐剂 CpG(C 佐剂)的发现源于早期学者对癌症治疗的探究,是一些具有免 疫活性的以未甲基化的 CpG 基序为核心的 DNA 序列,包括人工合成的含 CpG 基序的 CpG-ODN 和自然界中低等生物的基因组 DNA 大量的研究表明如果 CpG 基序缺失或 者胞嘧啶发生甲基化,则活性丧失(李艳环等, 2006) CpG ODN 可与传统的黏膜佐剂 CT 和 LT 产生协同效应,对人体无毒副作用,是一种极具应用前景的黏膜佐剂(石蓉等, 2006)