详解蛋白质电泳.ppt

蛋白质电泳 蛋白质的结构和性质 蛋白质是由一条或几条多肽链按各自特殊的组合方式形成具有完整生物活性的分子。 蛋白质是两性电解质，当处于等电点pI时，蛋白质分子本身静电荷为零，通常在偏酸性的溶液中带正电，在偏碱性的溶液中带负电。 温度，pH，化学因子等因素易引起蛋白质变性。 分离纯化方法 电泳：蛋白质是两性电解质，在一定pH条件下，蛋白质带有电荷，不同的蛋白质所带电荷种类和数量不同，因此在电场中移动的速度不同，从而把蛋白质分开。 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：有两种，添加SDS （十二烷基磺酸钠）的变性SDS和不添加SDS的非变性PAGE。 聚丙烯酰胺凝胶 它是由丙烯酰胺(Acr)和交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)在催化剂N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)和过硫酸铵(AP)作用下聚合交联成的三维网状结构的凝胶，有分子筛作用。 凝胶孔径随Bis~Acr比例的增加而变小。比例为1:20达到最小，一般实验按1:29配制，能分开相差约3%的蛋白质。 特点 透明，有弹性，机械性能好 化学性质稳定，不与被分离物起化学反应 对pH及温度变化较稳定，几乎无吸附和电渗作用 样品用量少，灵敏度高，可达10-6g 凝胶孔径可调节，分辨率高 SDS蛋白质与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物。由于十二烷基硫酸根带负电荷，使SDS-蛋白质复合物都带上负电荷，而且大大超过蛋白质原有的电荷量，所以掩盖了蛋白质原有的电荷量的差别，因此，蛋白质电泳的迁移率取决于蛋白质分子量的大小。此外，SDS使蛋白质构象改变为长椭圆棒，长度与分子量大小正相关，所以也可以用这种方法测蛋白质的分子量。 凝胶系统 根据缓冲液的pH值和凝胶孔径差异，分为连续凝胶系统和不连续凝胶系统 连续系统：电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。 不连续系统：缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度均不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均比前者好，目前使用最广泛。 三种物理效应 电荷效应:不同蛋白质所带的电荷种类和数目不同，在电场中的移动速度也不同，蛋白质带的负电荷越多，从负极向正极移动的速度越快，从而把不同的蛋白质分开。 分子筛效应：聚丙烯酰胺凝胶是网孔状结构，凝胶浓度越大，网孔越小，凝胶网孔大小与蛋白质分子大小在一个数量级，所以对蛋白质分子有筛分作用，分子越大，受到的阻力越大，迁移速度越慢。 三种物理效应 浓缩效应:浓缩胶的凝胶浓度小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，样品移动的速度较快；分离胶孔径小，样品移动慢，由于凝胶孔径的不连续性使样品迁移受阻而压缩成很窄的区带，最终样品几乎能同时进入分离胶进行分离。 在pH6.8的凝胶缓冲体系中： 前导离子或快离子：HCl解离出的C1- 尾随离子或慢离子：Gly-（甘氨酸等电点：5.97) 蛋白质P-速度介于两者之间 电泳时C1-走在最前面，其后形成一个离子浓度较低的低电导区，由于导电性与电场强度成反比，这一区带便获得较高的电压梯度，使得P-和Gly-加速移动，最终P-压缩成一狭窄的区带。 当进入分离胶时，凝胶的pH值（8.8）明显增加，甘氨酸大量解离，其有效迁移率超过蛋白质，直接在氯离子后移动，不再形成高电压梯度。同时由于凝胶孔径变小，使蛋白质分子的迁移率减小。于是蛋白质分子在均一的电压梯度和pH值中泳动，并根据其固有的带电性和分子大小进行分离。 谢谢 * * 有效迁移率： MCl- M P- MGly- Gly- P- Cl- Gly - P- Cl- Cl- Cl- Cl- P - P - P - Gly - Gly- Gly - pH为8.3的电泳缓冲液（Tris-Gly） pH为6.8的浓缩胶(Tris-HCl 大孔胶) pH为8.8的分离胶(Tris-HCl 小孔胶) *