基因工程2—工具酶.pdf

第二章 基因工程的工具酶 基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依 赖一些酶 (如限制性核酸内切酶，连接酶，DNA聚 合酶等)作为工具对基因进行人工切割，拼接和扩 增等操作。所以把这些酶称之为“工具酶”。工 具酶是对野生菌株（或真核生物如酵母）进行改 造、优化、而产生的生物工程产品。 基因工程工具酶 限制性内切酶 连接酶 DNA聚合酶 DNA修饰酶 RNA聚合酶 磷酸激酶和磷酸酶 核酸酶 第一节 限制性核酸内切酶 一、细菌的限制—修饰作用和限制性内切酶的发现 1、细胞的限制—修饰作用 ①50年代后Luria和 Human(1952) Bertani和 Weigle(1953)发现细菌的 “限制”现象. 感染 E.coli k Phageλ （k） E .coli B (E .coli B 限制 λ （k）) 不感染 ②仍有少量λ(K)可在 E.coli B中生存，是因 E.coli B对λ(K)进 行了修饰。 修饰 感染 E.coli B λ(k)* λ(k) E.coli(B) 细菌如何对λ噬菌体进行限制和修饰？ 细菌的限制—修饰系统 ①1962年W.Arber(瑞士)发现，寄主对噬菌体的修饰是 在Phage入的DNA上。 ②1965年，Arber发现修饰与λ的降解有关，提出：细 胞中存在位点特异性限制酶和特异性甲基化酶，即细 胞中有限制—修饰系统(R-M Restriction-modification system) 。R-M系统是细菌安内御外的积极措施。 细菌的限制和修饰现象  即限制性内切酶和与其对应的甲基化酶系统，称 R-M system  限制性内切酶识别特异的DNA序列并打断DNA， 同时对应的甲基化酶能把该段特异的序列甲基化， 使得限制性内切酶无法识别。  这种系统在细菌中起到了免疫的作用，即外来入 侵的DNA在限制性内切酶的作用下被水解，而细 菌自身的DNA在甲基化酶的作用下被保护起来。 限制性内切酶的发现 ①1968年Linn和Arber从E.coli B中发现限制 酶,M.Meselson和R.yuan从E.coli K中分离到另一限 制性的内切酶。 1970年Smith (美)在流感嗜血杆菌又发现另一限制 酶即限制酶 Ⅱ。 ②限制酶的功能：降解不同源DNA，而不降解同源 DNA。 ③1978年W.Arber 、H.O.Smith(美)，Nathans(美) 因发现限制性内切酶及对其功能研究的突出贡献获 得诺贝尔奖。 二、限制性核酸内切酶 （Restriction endonuclease） 是一类能够识别双链DNA分子中的某种 特定核苷酸序列 （4—8bp），并由此 处切割DNA双链的核酸内切酶。 1. 来源 原核生物。 2.性质 内切酶。 即在核酸分子链的内部制造切口的酶。 3. 功能 自我保护作用。 细菌的限制和修饰系统（R/M体系） （1）限制（Restriction） 限制性内切酶将侵入细菌体内的外 源DNA切成小片断。 （2）修饰（Modification） 细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化 修饰所保护，不能被自身的限制性内切 酶识别切割。 ① Dam甲基化酶(Mec甲基化酶)