DNA合成（链的延伸）-贵州大学生物技术试验教学中心.PPT

从20世纪中叶开始，分子生物学研究得到高速发展，主要原因之一是研究方法，特别是基因操作和基因工程技术的进步。 基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。 基因工程技术是核酸操作技术的一部分，只不过它强调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍与性状表达。 事实上，这种跨越物种屏障、把来自其它生物的基因置于新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工程技术区别于其它技术的根本特征。 三大成就： 一、在20世纪40年代确定了遗传信息的携带者、即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题； 二、50年代提出了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题； 三、50年代末至60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，阐明了遗传信息的流动与表达机制。 重组DNA技术史上的主要事件 重组DNA技术的四大要素 (1)限制性核酸内切酶 指一类能识别双链DNA分子中特定核苷酸序列，并在识别序列内或附近特异切割双链DNA的核酸内切酶。 它们主要是从原核生物中分离出来。第一个核酸内切酶EcoRI是Boyer实验室在1972年发现的，它能特异性识别GAATTC序列，将双链DNA分子在这个位点切开并产生具有粘性末端的小片段。 限制性核酸内切酶的类型 1）I型限制酶 在同一蛋白分子中兼有修饰(甲基化)作用及依赖于ATP的限制(切割)活性。它只结合于识别位点，但却随机切割回转到被结合酶处的DNA。 2）II型限制酶 是由两种酶分子组成的二元系统：一种为限制性内切核酸酶(限制酶)，它切割某一特异性的核苷酸序列；另一种为独立的甲基化酶，它修饰同一识别序列。 3）III 型限制酶 与I型限制酶一样具两种活性，只是它在识别位点上切割DNA，然后从底物上分开。 Ⅱ型能严格识别核酸序列，并在识别区内特定的核苷酸处切开DNA双链。故通常所指都是Ⅱ型限制性DNA内切酶。识别分四核苷酸和六核苷酸，其序列旋转对称。切口分平齐末端和黏性末端，产生3‘－OH和5’－P末端。其种类繁多，分子克隆中最为常用。 几种主要DNA内切酶所识别的序列及其酶切末端。 (2)DNA连接酶 能够催化DNA中相邻的3’-羟基和5’-磷酸基末端之间形成3’，5’-磷酸二酯键。 DNA连接酶可连接平末端，也连接黏末端。反应需有Mg2+和ATP存在，pH7.5-7.6。最适温度37℃，30℃以下活性明显下降，但考虑到被连接DNA 的稳定性和粘性末端的退火温度，一般平端连接用20-25℃，粘端连接用12℃左右。 1)不能催化两单链DNA分子连接； 2)只能连双链DNA分子的单链缺刻(nick)；不能连接双链中一个或多个核苷酸缺失所致缺口(gap)。 基因工程常用的载体 仅仅能在体外利用限制性核酸内切酶和DNA连接酶进行DNA的切割和重组，还不能满足基因工程的要求，只有将它们连接到具备自主复制能力的DNA分子上，才能在寄主细胞中进行繁殖。 具备自主复制能力的DNA分子就是分子克隆的载体（vector）。病毒、噬菌体和质粒等小分子量复制子都可以作为基因导入的载体。 载体(Vector)是把外源DNA(目的基因)导入宿主细胞，使之传代、扩增、表达的工具。载体有质粒(plasmid)、入噬菌体、柯斯质粒（Cosmid）、M13噬菌体和粘性末端质粒(粘粒)、病毒等。载体具有能自我复制；有可选择的，便于筛选、鉴定的遗传标记；有供外源DNA插入的位点；本身体积小等特征。 在基因工程中质粒常被用做载体(Vector)。 质粒存在于多种细菌，是染色体（核）以外的独立遗传因子，由双链环状DNA组成，几乎完全裸露，很少有蛋白质结合。质粒有严紧型和松弛型之分。严紧型由DNA多聚酶Ⅲ复制，一个细胞可复制1-5个质粒。而松弛型由DNA多聚酶Ⅰ复制，一个细胞可复制30-50个质粒。 在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。人工构建的质粒可以集多种有用的特征于一体，如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等。常用的人工质粒运载体有pBR322、pSC101。pSC101与pBR322相似，只是没有抗氨苄青霉素基因和PstI切点。 pBR322含有抗四环素基因(Tetr)和抗氨苄青霉素基因(Ampr)，并含有5种内切酶的单一切点。如果将DNA片段插入EcoRI切点，不会影响两个抗生素基因的表达。但是如果将DNA片段插入到Bam HI 或 Sal I切点，就会使抗四环素基因失活。这时，含有DNA插入片段的pBR322将使宿主细菌抗氨苄青霉素，但对四环素敏感。没有DNA插入片段的pBR322会使宿主细菌既抗氨苄青霉素又抗四环素，而没有pBR322质粒的细菌将对氨苄青霉素和四环素