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原核表达操作步骤及注意事项 将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点： 易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。 ????表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件： （1）选择标志的编码序列； （2）可控转录的启动子； （3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)； （4）一个多限制酶切位点接头； （5）宿主体内自主复制的序列。 ????原核表达一般程序如下：? 获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测 一、试剂准备 1、LB培养基。 2、100mM?IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g?IPTG溶于100ml?ddH2O中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。 二、操作步骤 （一）获得目的基因 1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。 2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。 （二）构建重组表达载体 1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。 2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。 （三）??获得含重组表达质粒的表达菌种 1、?将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗Amp或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。 2、?测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。 3、?以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。 （四）诱导表达 1、?挑取含重组质粒的菌体单斑至2ml?LB（含Amp50μg/ml）中37℃过夜培养。 2、按1∶50比例稀释过夜菌，一般将1ml菌加入到含50mlLB培养基的300ml培养瓶中,?37℃震荡培养至OD600≌0.4-1.0（最好0.6，大约需3hr）。 3、取部分液体作为未诱导的对照组,余下的加入IPTG诱导剂至终浓度0.4mM作为实验组,两组继续37℃震荡培养3hr。 4、分别取菌体1ml,?离心12000g×30s收获沉淀，用100μl?1%SDS重悬，混匀,?70℃10min。 5、离心12000g×1min，取上清作为样品,可做SDS等分析。 三?、注意事项 1、选择表达载体时，要根据所表达蛋白的最终应用考虑。如为方便纯化，可选择融合表达；如为获得天然蛋白，可选择非融合表达。 2、融合表达时在选择外源DNA同载体分子连接反应时，对转录和转译过程中密码 基因表达技术 2007年5月16日09:43 生物技术世界 ? 　　目前，基因表达已经成为生物学、医学和药物开发研究中的主流技术。基因表达就是基因转录及翻译的过程。广义来说，基因表达有两类：分析型和功能型。前者是指检测和定量基因，尤其是在比较两个样本时，如处理/非处理，疾病/正常。功能型的基因表达，目的是获得一定数量的蛋白质。Invitrogen公司的JudyMacemon称，在她的顾客中，对研究基因功能的基因表达/敲除感兴趣的人是采用基因表达制造蛋白质的人的两倍。 　　cDNA过度表达优势大 　　经典的基因表达操作常对病变细胞或组织、以及用药治疗之后的情况进行比较。为了验证某种化合物对基因的效果，研究人员用siRNA或反义化合物返回去做敲除试验。这些技术可以让基因或者基因组表现出特殊的沉默现象。OpenBioSystems公司的PaulTodd博士指出，虽然基因敲除很流行，但它不是证实基因性能的唯一方法。 　　Todd博士把cDNA过度表达称之为基因敲除的“合理逆转”。siRNA是让基因沉默，以确定基因下游的效应，而cDNA引入许多目标基因的复制样本，引起基因及其下游产物都超表达。很多时候，从cDNA获得的信息要比siRNA的信息要更好，Todd认为这与设计无关。 　　采用siRNA方法，研究人员必须确定短寡聚核苷酸序列，该方法可以