实时荧光定量pcr技术与原理.ppt

 如果两组标准曲线的斜率，即M值的差小于0.1，表明两个基因的扩增效率已非常接近，那么后续实验中就可以用Comparative Delta-delta Ct法进行相对定量分析。 反之，如果M差值大于0.1，就无法用该方法进行相对定量分析。此时的解决方法有两种，一是优化实验，使两组标准曲线的斜率差值小于0.1，二是换用其它的相对定量方法。 1. Comparative Delta-delta Ct法的一大特点是，每次实验都默认目的基因和看家基因的扩增效率一致，而并非真实扩增情况的反映，因此实验条件需要严格优化，并且总会存一定的偏差。 2. 当优化的体系已经建立后，在每次实验中无需再对看家基因和目的基因做标准曲线，而只需对待测样品分别进行PCR扩增即可。  1. 双标准曲线法做相对定量分析的最大特点是，应用简便，无需像Delta-delta CT法那样对实验进行严格的优化。2. 其不足之处是每次实验都必需对目的基因和看家基因做两组标准曲线。 设计实验方案：例如对样品、试验组和对照组的一个实验流程设计 引物和探针的设计和合成 提取RNA，测定RNA的浓度 反转录 定量PCR 数据分析 相对定量方法-- Delta-deltaCt法 相对定量方法-- Delta-deltaCt法 在预实验中，必需对目的基因和看家基因做两组标准曲线 相对定量方法-- Delta-deltaCt法 相对定量方法-- Delta-deltaCt法 相对定量方法--双标准曲线法 ??????????????????????????????????? 公式： 相对定量方法--双标准曲线法 * 800免费电话：800-810-2177 实时荧光定量PCR技术的原理及应用 (Real time Quantitative PCR) 实时荧光定量PCR 实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。 讲 座 提 纲 实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量技术的应用 实时荧光定量PCR定义 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线和Ct值对未知模板进行定量分析的方法 。 实时荧光定量PCR原理定量原理 介绍三个概念： 扩增曲线、荧光阈值、Ct值 如何对起始模板定量？ 通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析 实时荧光定量PCR 原理 -------- 扩增曲线 扩增曲线图： 横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度 每个循环进行一次荧光信号的收集 荧光基团 荧光检测元件 实时荧光定量PCR 原理 -------荧光阈值 荧光信号阈值 （threshold ）： 前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值 荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍,即：threshold = 10 ′ SD　cycle 6-15 手动 设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于0.99 真正的信号:荧光信号超过域值 实时荧光定量PCR 原理 -------Ct值 Ct值的定义： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数 C(t) value 实时荧光定量PCR 原理 -------Ct值的重现性 横轴：PCR反映循环数 纵轴：荧光信号量 Ct值的特点： 相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定； Ct值则极具重现性 实时荧光定量PCR 原理 --------- 标准曲线 模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小 Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量 讲 座 提 纲 实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量PCR实验设计及应用 实时荧光