第4章提取的基本理论200506.doc

第4章 生化活性物质提取技术 生化活性物质提取技术概述 提取是指目标生化活性物质与细胞固体成分或其他结合成分的分离，由固相转入液相或由细胞内生理状态转入外界特定溶液环境的过程。有固液提取和液液提取两种形式。 固液提取是指被提取物在胞内呈固相或与固体结合存在,提取时由固相转入液相的过程,多指初级分离阶段。如：中草药有效成分的水煮、醇提，海藻中多糖的水提醇沉等。 液液提取是指被提取物原来呈液相存在,提取时由某一液相转入另一互不相溶的液相过程，多贯穿于整个分离纯化过程。如：石油醚萃取果蔬粗提液的叶绿素,热苯萃取发酵液中扁桃酸等。 提取的原理和策略 提取的原理主要是根据不同物质在不同溶剂中溶解度的差异，达到目标生化活性物质与杂质的分离。 溶解度的差异用于分离制备有两个主要目的或策略: ①选择一个对目标生化活性物质溶解度大而对杂质溶解度小的溶剂，使目标生化活性物质从混合组分中选择性地被分离出来。如：酵母醇脱氢酶的热变性提取，就是基于醇脱氢酶的热稳定性较高，而杂蛋白的热稳定性较低的特性，采用55℃高温去除热变性杂蛋白、而醇脱氢酶多处于上清液中的方法。 ②选择一个对目标生化活性物质溶解度小而对杂质溶解度大的溶剂，使目标生化活性物质沉淀或结晶析出。如：利用啤酒酵母泥提取脱氧核糖核酸（DNA）就是基于RNA的PI = 2.0～2.5，而DNA的PI = 4.2的特点，以及当提取体系中NaCl浓度为0.14 mol/L和1 mol/L时，DNA的溶解液分别为NaCl浓度为0.5 mol/L时的11%和200%，而RNA的溶解度变化不大的特点。通常可采用在pH = 2.0的1 mol/L NaCl体系进行粗提，然后调整体系pH = 4.0～4.5且NaCl浓度为0.14 mol/L进行PI沉淀。 提取的基本原则 通常，提取的原则主要包括如下四方面： ①极性原则，极性物质易溶于极性溶剂，非极性物质易溶于非极性溶剂； ②酸碱性原则，碱性物质易溶于酸性物质，酸物质易溶于碱性物质； ③温度效应原则，一般地温度升高则溶解度升高； ④pH原则，pH值远离生化活性物质的等电点则溶解度升高。 提取的主要影响因素 在实际操作中，影响提取的主要因素有三个：被提取物在提取溶剂中溶解度的大小，被提取物由固相扩散到液相的难易程度和被提取物在不同溶剂中的分配效应。 1.溶解度大小的影响： 生化活性物质溶解度大小主要与物质的自身分子结构，如基团的亲水平衡值基团的排列和偶极距等内因有关，外部影响因素主要是指所用溶剂如水、有机溶剂、稀盐缓冲液等理化性质、提取过程的温度、提取体系的pH值和离子强度等。尤其要注意的是，对特定的生化活性物质而言，一种物质溶解度的大小与溶质和溶剂的性质息息相关，是溶质-溶质，溶质-溶剂，溶剂-溶剂三个相互作用力综合平衡的结果，在此，相互作用力主要有：偶极-偶极相互作用，偶极-诱导偶极相互作用，弥散力，氢键，离子基团的静电作用等。外部因素更多时候是通过该种综合平衡来实现对溶解度大小的影响。 2．固液萃取中扩散难易的影响： 被提取物由固相扩散到液相的难易程度主要遵从Fick扩散第一方程式： dM = D ( F ( dC/(dX ( t)， 其中D = k ( T/(μ ( M) 式中：dM-已扩散的物质量；D-扩散系数；F-扩散面积；dc-两相界面浓度差，为扩散过程的推动力；dx-溶质扩散的距离；t-提取时间；T-提取温度；μ-粘度；M-分子量；k-校正因子。 扩散的影响因素及其应用: 升温有助于扩散量dM的提高，但对生物大分子而言，升温是有一定限度的，否则将破坏其生理活性 粘度下降则扩散系数上升，导致扩散量dM的提高如：提取蛋白质或酶时，加入核酸酶破坏大分子核酸或加入鱼精蛋白硫酸链霉素沉淀核酸，可使溶液粘度下降，dM提高 搅拌使已扩散的溶质迅速与溶剂混合，能保持两相界面的最大浓度差, 则扩散系数上升 提高细胞破碎程度, 则扩散面积F提高，dx下降，有助于扩散量dM 的提高。 延长提取时间t，则dM上升 采用分次提取有助于提高dC，从而扩散量dM大为提高。Xn=[K*W/(K*W+L)]n 这点与分批洗涤过滤类似 ①中成药胃得安有效成分胎盘活性蛋白因子的提取：将人或动物胎盘破碎至一定程度，过16～30目筛，取胎盘颗粒于水提系统中，加入10倍量水，加入适量核酸酶，100 rpm搅拌下，采用文火加热的方式提取2 h，其间换水2～3次。 ②酵母异柠檬酸脱氢酶的提取：取微生物发酵液的新鲜面包酵母泥100 g，加入20 ml 0.1 mol/L NaHCO3溶液和适量的玻璃砂，于研钵中，冰浴下反复研磨，2000 rpm离心10 min后收集上清液，加入pH 7.4 30 mmol/L TrisHCl缓冲液配制的异柠檬酸，于37℃恒温水浴10 min后，340 nm测