基因工程制药-4纯化.质控.ppt

基因工程制药（4.纯化.质控） 获得目的基因 ↓ 组建重组质粒 ↓ 构建基因工程菌(或细胞) ↓ 培养工程菌 ↓ 产物分离纯化 ↓ 除菌过滤： ↓ 半成品检定 ↓ 成品检定包装 3.8基因工程药物的分离纯化 一.特点和分离纯化的基本过程 1.特点： 初始物料组成复杂 目的产物含量较低 稳定性差 质量、纯度要求较高 产品(目的产物)质量的要求 产品用途决定纯度要求： 体外诊断试剂允许一定量的杂质存在，要求纯度在80%以上； 体内治疗用产品应具高纯度98%以上。 产品活性: 产品剂型，贮存要求和稳定性。 2.分离纯化的基本过程 二.分离纯化技术 (1) 细胞收集：离心分离，膜过滤　 高速组织捣碎机 超声波细胞破碎仪超声波破碎法(中、小量) 非机械破碎法: 酶溶法: 利用生物酶将细胞壁和细胞膜溶解的方法。常用的酶有溶菌酶、葡聚糖酶、蛋白酶、壳多糖酶等。溶菌酶对细菌作用效果好。 化学渗透法： 利用有机溶剂(苯、甲苯)、抗生素、表面活性剂(SDS、Triton)、金属螯合剂(EDTA)、变性剂(脲、盐酸胍)等可以改变细胞壁或细胞膜的通透性,从而使内含目的物有选择地渗透出来。 选择破碎法一般原则: 若提取的产物在细胞质内,需用机械破碎法； 若在细胞膜附近则可用较温和的非机械法; 若提取的产物与细胞膜或壁相结合时,可采用机械法和化学法相结合的方法。 (3)固液分离(离心、膜过滤、双水相分配) 离心沉淀是固液分离的主要手段,包括高/超速 离心。 膜过滤技术有微滤、超滤和反渗透等。 微滤(0.05-12um)　分离细胞、细胞碎片、包含体和蛋白质沉淀物等固体颗粒; 超滤 (0.003-0.08um)　浓缩、纯化蛋白质、多糖和核酸等大分子物质; 反渗透 (0.001- 0.01um)用于脱去抗生素、氨基酸等小分子中的水分。 超滤膜仅截留相对分子质量较大(约103_ 106) 的有机物质 双水相萃取系统是由两种水溶性高聚物或一种高聚物与无机盐在水溶液中混合而成,由于两相均含较多的水,称为双水相。 　　常用的双水相系统有聚乙二醇(PEG)/葡聚糖、聚乙二醇(PEG)/无机盐。 2.目的产物（重组蛋白质）的分离纯化 蛋白质分离方法的选择 蛋白质产物的性质 方 法 电荷（等电点） 离子交换（IEX） 分子量 凝胶过滤（GF） 疏水性 疏水（HIC）反相 （RPC） 特异性结合 亲和（AC） (1)亲和色谱(affinity Chromatography AC) Sample application and wash 亲和层析 选择性最强； 不放在第一步； 否则： 杂质多，寿命短； 体积大，介质贵 Production and purification of fusion proteins Schematic overview of GST fusion protein purification using GSTrap.   (2)离子交换色谱 (ion exchange chromatography,IEC) 1 2 3 4