高级实验技术-实时荧光定量pcr(2012-11-1).ppt

影响PCR扩增效率的因素: PCR定量的困难? 引物/靶的杂交 反应试剂的相对量 样本在扩增仪中的位置的不同 临床样本中DNA聚合酶抑制物的存在 PCR扩增模板的量 靶核酸链的再退火及酶过量可致E降低 定量的最佳时期 PCR 和定量问题 定量PCR ——外标准方法 在扩增检测待测样本的同时，扩增一系列稀释的已知标准（通常为质粒DNA） 如果在该标准稀释系列范围内，扩增产物/模板成线性相关，则可推导出同时扩增的待测样本中PCR模板的相对量 定量PCR ——外标准方法 定量PCR ——外标准方法 优点： 方法简便，容易建立 使用双孔重复测定 可得到非常准确的结果 甚至可排除管间的差异 不能排除样本间的差异 定量PCR ——外标准方法 缺点 PCR反应体系的微小区别也会对测定造成较大的影响 在扩增效率上的差异，会使定量测定精密度和重复性不佳 使用外标定量的要求 必须进行方法的精密度（批内变异）和重复性（批间变异）分析，以确定其应用的局限性 必须在扩增的指数期进行 酶联杂交法 捕获探针（检测TNF-α） 3 – TCGGCGTAGCGGCAGAGGATGGTCT-CCCCCC-NH2- 5 检测探针（检测TNF-α） 3- Biotin-TTGGGGCTCACTGTTCGGACATC GGGTA- 5 酶联杂交法 定量PCR  ——动力学方法 首先，确定PCR扩增的效率（E） 然后，根据相应的公式计算原始模板数 影响PCR扩增效率（E）的因素 整个扩增过程中：E 取决于： 引物/靶核酸的杂交 反应试剂的相对量 DNA聚合酶/靶核酸之比例* 其他可能影响E 的因素（系统之间的差异） 样本在扩增仪中的位置 不同的临床样本中DNA聚合酶抑制物的去除程度 靶核酸链的再退火及酶过量可致Ev降低 改良方法：极限稀释分析 首先将原始模板进行梯度稀释 然后对该稀释系列进行PCR扩增测定 最低的阳性样本被认为含有与一已知的标准稀释系列中最后的阳性样本中相同量的PCR模板 极限稀释法示意图 极限稀释法 优点： 不需要特殊设备 方法简单 缺点： 极限稀释分析的缺点 ①必须建立扩增反应条件的标准化：如初始含量、试剂浓度和比例、循环参数等 ②不同批次的PCR测定的效率有可能不同，因而测定重复性较差 ③含低拷贝数的样本中存在高斯（Gaussian）（正态）分布。因此，为正确判定最低阳性样本，必须对每一稀释度多次重复测定 严格注意污染，避免假阳性的产生 阈值 CT值 荧光信号穿过阈值线时的循环次数 不同读板温度对实验结果的影响：80℃ 不同读板温度对实验结果的影响：86℃ Taqman探针反应体系的设计 引物、探针设计原则： 优先选择探针的序列； Tm值应比引物的Tm值高8－10度（68－70）； GC含量：30－80％； 长度不应超过30碱基，18-30bp, optimal 20 ； 5’端不应是G，G有可能会淬灭荧光素。 Taqman探针反应体系的设计 选择合适的模板链，使探针的CsGs； 扩增片断不超过400bp，通常为80－150bp。避免相同碱基连续出现，特别是四个或四个以上Gs连续出现； 引物应尽量靠近探针； 引物的Tm值为59－60度，长度约20碱基； 避免引物、探针之间的二级结构。 Taqman探针反应体系的设计 引物、探针浓度的优化 目标：最高的信号/背景比，最小的Ct值 引物浓度：50nM－900nM 探针浓度：50nM－250nM 通过多次实验确定各自的浓度和比例 Taqman探针的不足 采用荧光淬灭及双末端标记，淬灭难以彻底，本底较高； 采用酶外切活性，受酶性能影响； 探针标记成本较高。 改进：用不发光的淬灭荧光分子取代TAMRA 实时荧光定量PCR技术的应用 病原体检测； 肿瘤研究； 基因表达研究； 免疫组份分析； 基因突变及多态性的研究 实时荧光定量PCR技术的应用 病原体检测： 检测患者血清中肝炎病毒浓度为临床药物治疗和疗效观察提供依据； 检测HIV的量预测发病时间； 选择治疗药物：干扰素对肝炎病毒高拷贝者不敏感，对低拷贝者敏感。 实时荧光定量PCR技术的应用 肿瘤研究： 癌基因及其相关基因的定量检测可进行肿瘤的早期诊断、分型、分期和预后判断； 检测治疗中和治疗后微量残余恶性细胞存在的数量，作为治疗效果和估计复发危险性的依据。 基因差异表达研究 标准曲线法 使用标准曲线来确定基因表达上的差异 相对定量法(2－△△Ct法) 不使用标准曲线，直接分析得到基因差异表达的倍数关系 标准曲线法 步骤： 1.通过标准曲线分别测出目