Ezrin在UMR106骨肉瘤细胞株移植瘤成瘤及肺转移中作用的实验研究.doc

Ezrin在UMR106骨肉瘤细胞株移植瘤成瘤及肺转移中作用的实验研究 王忠良1 李旭良2 张德文1 李明1 覃佳强1 刘传康1 刘星1 曹豫江1 （1重庆医科大学附属儿童医院矫形外科，重庆400014；2重庆医科大学附属儿童医院泌尿外科，重庆400014） 摘 要：目的 探讨膜-细胞骨架联接蛋白ezrin对骨肉瘤细胞株UMR106成瘤及转移能力的影响。方法 为获得较好的干扰效果，针对大鼠Villin2基因（ezrin编码基因）设计两个发夹式RNA（shRNA）。合成后克隆入载体pGenesil-1，扩增并中量提取质粒，应用脂质体LipofectamineTM 2000转染进UMR106细胞。采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和western印迹检测ezrin的表达。选取效果最好的shRNA转染UMR106细胞并行G418筛选，传代扩增。扩增后细胞原位接种到SD大鼠胫骨结节，并设立正常细胞组和阴性对照组，观察记录肿瘤形成和大鼠存活时间，计数肺表面转移灶数目，镜检定位增强型绿色荧光蛋白（Enhanced green fluorescence protein，简称EGFP）在原发灶和肺转移内的表达。结果 ⑴shRNA1干扰作用最明显，ezrin蛋白表达下调达90%。⑵移植时稳定转染细胞数约50%。⑶实验组与对照组均100%成瘤，成瘤时间正常细胞组为10.25±1.07天，阴性对照组为10.08±0.88天，实验组为10.3±1.08天，三者间没有明显差别（p0.05）；实验组存活时间（42.3±17.25天）明显长于正常细胞组（20.6±11.70天）和阴性对照组（22.4±7.42天）（p0.0001）；实验组肺转移灶数目明显低于正常细胞组和阴性对照组，分别为39.4±51.86个、124.6±39.78个和117.6±36.48个（p0.0001）；阴性对照组中原发灶和肺转移内均有EGFP表达，而实验组肺转移灶内未见EGFP表达。结论Ezrin蛋白是骨肉瘤肺转移中的一个关键因子，干扰Ezrin蛋白表达能抑制其肺转移的发生，可以作为预防骨肉瘤肺转移的靶点。 关键词：Ezrin蛋白；原位移植；RNA干扰；肺转移 中图法分类号：R730.59 文献标识码：A An experimental study of the influence of ezrin on tumor formation and pulmonary metastasis of UMR106 cell strain in rat osteosarcoma model using orthotopic transplantation WANG Zhongliang1, LI Xuliang2, ZHANG Dewen1, LI Ming1, QIN Jiaqiang1, LIU Chuankang, LIU Xing, CAO Yujiang （1Department of Orthopedic Surgery, Children Hospital of Chingqing Affiliated to Chongqing University of Medical Sciences, Chongqing, 400014, China. 2 Department of Urinary Surgery, Children Hospital of Chingqing Affiliated to Chongqing University of Medical Sciences, Chongqing, 400014, China.） Abstract：Objective To investigate the effect of membrane-cytoskeleton linker ezrin on tumor formation and pulmonary metastasis of UMR106 cell. Methods Two small hair RNA targeting to Villin2 gene （ezrin coding gene） was designed, chemically synthesized and inserted into plasmid pGenesil-1, then transformed into E.Coli DH5α.The recombinant plasmid was extracted in middle quantity and transfected into UMR106 cells by LipofectamineTM 2000. Ezrin in UMR106 cel