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基因工程育种技术 基因工程又称重组DNA技术，是指将一种或多种生物的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物受体，使受体按人们的愿望表现出新的性状。 基因工程诞生于1972年，在其后几年中由于担心重组生物对环境安全的影响，基因工程技术的发展曾一度受挫。但随着人们对DNA重组所涉及的载体和受体系统进行有效的安全性改造，以及相应的DNA重组实验室设计和操作规范的建立，再加上重组DNA技术的巨大应用潜力的诱惑，重组DNA技术迅速发展，现在，基因工程已成为生物学实验室的一项常规技术，并广泛应用于医药、农业、食品、环保等许多领域。 第一节 基因工程的基本过程和原理 基因工程最典型的操作如图6-1所示一般包括以下三个步骤： 1．外源DNA的获得与酶切2．外源DNA与经同样酶切的载体的连接3．连接产物转化受体细胞及阳性转化子的筛选 图6-1 基因工程的基本过程 由图61可见，基因工程操作过程需要以下基本材料：外源DNA基因、载体、DNA体外重组用的酶以及宿主细胞。 一、 载体 外源基因导入受体细胞一般都要借助于载体，基因工程中最常用的载体是质粒载体。图6-2所示pUC19就是最常用的载体之一。 图6-2 载体pUC19及其多克隆位点 载体一般含有以下几个基本元件： (一) 复制原点 载体在宿主细胞中要独立存在则应具有独立复制的能力，复制原点又称为复制起始位点Origin，简称ori，控制载体复制。不同生物的载体复制原点不同，同一种生物的不同载体拷贝数和稳定性有很大差别，这主要决定于载体的复制原点的性质。图6-2所示的pUC系列载体的复制原点是pAM1的一个突变体，在合适的大肠杆菌宿主细胞中如大肠杆菌JM109其拷贝数可达500。整合型载体的复制原点被整合位点的同源序列替代。 (二) 筛选标记 一般是载体上的一段编码酶的基因，能赋予转化子新的性状，便于转化子的筛选。载体pUC19的筛选标记是β-内酰氨酶基因（常简写为bla或Ampr），能分解氨苄青霉素中的β-内酰氨环使其失活，因此在含氨苄青霉素的平板上，只有含质粒的转化子能生长而不含质粒的宿主细胞不能生长。抗药性是细菌载体中最常用的筛选标记，除氨苄青霉素抗性外，卡那霉素、氯霉素、四环素等抗性也常用作载体的标记。另一类常用的标记是营养缺陷型互补标记，在真核生物载体中更常用。 (三) 多克隆位点（multi cloning site, 简写为MCS） 载体中用于插入外源基因的区域，往往是一段人工合成的序列，这一序列中含多种限制性核酸内切酶的识别位点。图6-2下方即为载体pUC19的多克隆位点，这一段序列可被十多种限制性内切酶识别，酶切后能产生多种黏性末端，有利于外源DNA片断的插入。 除质粒载体，cosmid、细菌人工染色体Bacterial Artificial Chromosome，BAC、酵母人工染色体Yeast Artificial Chromosome，YAC等也是基因工程中常用的载体，这些载体适合于插入长片段的外源DNA，主要在构建基因库时使用。 二、DNA重组用酶 DNA重组过程最常用的酶是限制性核酸内切酶和连接酶，这两种酶几乎应用于DNA重组的所有实验中。 (一) 限制性核酸内切酶（Restriction Endonuclease） 目前已发现的限制性核酸内切酶有600多种，根据性质不同分为3类，基因工程中常用的是II类酶，这类酶有比较专一的识别和切割位点，通常专一性的识别DNA序列中4～6个碱基的回文序列。表6-1列出了几种最常用内切酶的识别序列。 表6-1 常用的限制性核酸内切酶 限制性内切酶 识别位点 产生的黏性末端 BamH I 5’-GGATCC-3’ 3’-CCTAGG-5’ 5’-G-3’ 3’-CTTAA-5’ EcoR I 5’-GAATTC-3’ 3’-CTTAAG-5’ 5’-G-3’ 3’-CTTAA-5’ Hind III 5’-AAGCTT-3’ 3’-TTCGAA-5’ 5’-A-3’ 3’-TTCGA-5’ Pst I 5’-CTGCAG-3’ 3’-GACGTC-5’ 5’-CTGCA-3’ 3’-G-5’ Sal I 5’-GTCGAC-3’ 3’-CAGCTG-5’ 5’-G-3’ 3’-CAGCT-5’ Sma I 5’-CCCGGG-3’ 3’-GGGCCC-5’ 5’-CCC-3’ 3’-GGG-5’ Kpn I 5’-GGTACC-3’ 3’-CCATGG-5’ 5’-GGTAC-3’ 3’-C-5’ 限制性内切酶和后面介绍的连接