小鼠大脑皮层和海马神经元的分离与培养20110110.docVIP

小鼠大脑皮层和海马神经元的分离与培养 一、玻片的准备 A．玻片的清洗 1. 第一天，将玻片(12mm，633009，Carolina) 逐片置于装有浓硝酸 (HNO3) 或者洗液的平皿中，混匀，然后浸泡过夜。 2. 第二天，将玻片放在有单蒸水的陶瓷盘中，搁在摇床上晃动，速度为200rpm，将玻片上的硝酸残液清洗干净。每10min换水一次，要换20次以上。晚上置于双蒸水中浸泡过夜。 3. 第三天，换双蒸水，重洗两次，每次速度为200rpm ，时间为60min，去除玻片上的离子和其它杂质，最后再换用无水乙醇，清洗三次以上。洗完后置于小烧杯中，拿到细胞房超净台将玻片浸泡在无水乙醇中室温保存。 4. 解剖小鼠取细胞前两天将玻片从无水乙醇中取出，在酒精灯焰上烘干，稍微在空气中停一下，再放到灭菌的parafilm膜上。玻片高温易碎，速度要快。完成后在紫外下照射1h。 B. 玻片的包被（PDL包被） 用0.1M的硼酸钠溶液将PDL配成0.01mg/ml PDL的溶液(pH 8.4)。 准备500ml 0.1M的硼酸钠（Na2B4O7·10H2O, B3545-500G，Sigma）溶液。 在超净台中，往一整瓶Poly-D-Lysine（PDL，5mg/ml，Sigma, P6407-5MG）中加入25ml的该硼酸钠溶液。盖上瓶盖，溶解5min，可以轻轻晃动。然后将该溶液加到剩下的硼酸钠溶液中。即为所配溶液，0.22μm过滤，用锡纸包好，4℃避光保存。 使用的时候，6/12/24孔板每孔加1ml/500μl/250ul的PDL溶液，12mm盖玻片每片加50μl的PDL溶液，放在超净台中，室温包被4hrs或者过夜。 第二天，紫外照射超净台1-2hrs，再将PDL吸干。将板和玻片盖揭开，室温晾过夜。 第三天，将每个孔/玻片用灭菌水洗两遍，吸干，盖上盖，避光待用。 二. 大脑皮层与海马的解剖 A. 解剖前的准备 解剖器械的灭菌 解剖前将器械放在铝饭盒中，倒入75%乙醇，并在超净台中放入适量卷纸，打开紫外杀菌1-2hrs。 解剖显微镜1台 手术剪1把 眼科弯头镊子2把 弹簧剪1把 眼科手术剪1把 精细45度角镊子1把（进口） 精细直镊子1把（进口） 精细弯头维纳斯剪1把（进口） 2. 冷冻解剖液的准备 超净台中，取解剖液（Dissection Medium，DM）于3个35mm无菌培养皿（底盖均加）中，放在冰袋上。 Dissection Medium： HBSS （H2387-10X1L，Sigma） HEPES 10mM （H6147-100G， Sigma） Glucose葡萄糖 33.3mM （G6152-500G，Sigma） [CaCl2 2mM (C7902-500G, Sigma) ]可选 Gentamycin庆大霉素 5μg/ml （15710-64，Invitrogen） BSA 0.3% （15260-037， Invitrogen） MgSO4 12mM （M2643-500G，Sigma） 0.22μm过滤除菌，存放在4℃. 消化液（Digestion Solution，DS）的准备：按以下配方配置好溶液。 Digestion Solution: NaHCO3 4.2mM （S5761-500G，Sigma） HEPES 25mM （H6147-100G， Sigma） NaCl 137mM （S5886-500G，Sigma） KCl 5mM （P5405-250G，Sigma） Na2HPO4 7mM （S5136-100G，Sigma） 以NaOH（S2770-100ML, Sigma）调节pH至7.4。 以250ml Digestion Solution溶解Trypsin（T1005-500MG，Sigma）1瓶，使终浓度为2mg/ml，0.22μm过滤除菌，分装后存放在-20℃。使用前在4℃融化。 以Digestion Solution溶解DNase I（D5025-150KU，Sigma）1瓶，使终浓度为1mg/ml，0.22μm过滤除菌，分装后存放在-20℃。使用前在4℃融化。 6．Neurobasal培养液(Culturing medium)和铺板培养液（Plating Medium），配方如下： Culturing Medium: Neurobasal-A Medium 500ml (1瓶，10888-022, Invitrogen) B