植物基因工程复习整理资料.doc

《植物基因工程》复习资料整理 第一部分 概述 植物基因工程：采用工程设计的方式，通过体外DNA重组技术，将特定的外源基因导入受体植物细胞内，由此获得的转化植物可以表现出预期的遗传特性，具有上述特点的科学被称之为植物基因工程。 第二部分 转化系统 1.转化外源DNA通过载体﹑媒体或其他物理﹑化学方法导入植物细胞并得到整合及表达的过程。实现这一过程的途径称之为“转化系统”2.转化外源DNA通过载体﹑媒体或其它物理﹑化学方法导入细胞并得到整合及表达的过程。Transformation 3.T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA，称为转移DNA。 4.Ti质粒致瘤原理5.T-DNA的结构特点Ti质粒T-DNA区的长度约为23kbT-DNA仅存在于植物肿瘤细胞的核DNA中；T-DNA含有激发和保持肿瘤状态所必需的基因；T-DNA和植物DNA之间没有同源性。c.在T-DNA的5′端和3′端都有真核表达信号。如TATAbox、AATAAbox及polyA等。e.T-DNA的两端左右边界各为25bp的重复序列，即边界序列（border sequence），分别称之为左边界（BL或TL）和右边界（BR或TR）。该25bp边界序列属保守序列,但通常右边界（TR）序列更为保守，左边界(TL)序列在某些情况下有所变化。其核心部分是14bp，可分为10bp(CACGATATAT)及4bp(GTAA)两部分,是完全保守的。f.左边界（TL）缺失突变仍能致瘤,但右边界（TR）缺失则不再能致瘤,几乎完全没有T-DNA的转移,这说明右边界(TR)在T-DNA转移中的重要性。 6.T-DNA在植物细胞中的整合过程（原理）T-DNA在植物染色体中的插入是随机的，可以插入任何一条染色体，但插入的位点有以下特点：a. T-DNA优先整合到转录活跃的植物基因位点。b. T-DNA与植物DNA连接处富含A、T碱基对。c.植物DNA上的插入靶位点与T-DNA边界序列，有一定程度的同源性。 7.直接把野生型Ti质粒作为载体存在的问题：a. Ti质粒大，不易直接操作。b.酶切位点太多。c.T-DNA区内有许多不需要的编码基因。d. Ti 质粒不能在大肠杆菌中复制，得到重组质粒，只能在农杆菌中扩增，而农杆菌的接合转化率很低。e. Ti质粒上有一些对于T-DNA转移不起任何作用的基因。 8.先将T-DNA片段克隆到大肠杆菌的质粒中，并插入外源基因，最后通过接合转移把外源基因引入到农杆茵的Ti质粒上，这是一种把预先进行亚克隆、切除、插入或置换的T-DNA引入Ti质粒的有效方法。 带有重组T-DNA 的大肠杆菌质粒衍生载体称为“中间载体”（intermediate vector），而接受中间载体的Ti质粒则称为受体Ti质粒（acceptor Ti p1asmid），一般是卸甲载体（disarmed vector）。 9.卸甲载体就是无毒的（non-oncogenic）Ti质粒载体。在这种Onc-载体中，已经缺失的T-DNA部位被大肠杆菌的一种常用的质粒取代（如：pBR322）。 特点：a.含有T-DNA边界区和T-DNA区以外的全部序列。b.右边界区附近的nos保留，可鉴别转化细胞。 c. onc基因被删除，转化的植物细胞可以正常分化。d. onc区被pBR322代替，含有Apr基因。 10.一元系统中间载体的特征：①中间载体必须含有与Ti质粒T-DNA区同源的序列，此外含有pBR的序列，在其被引入到根癌农杆菌后即可高频地与Ti质粒的T-DNA的同源序列进行重组；②它应具有一个或几个细菌选择标记，便于筛选共整合质粒；③它必须有bom位点，在有诱导质粒存在的情况下，bom位点的存在可以使中间载体在不同细菌细胞内进行转移；④它应该含有阳性植物选择标记，以利于转化植物细胞的筛选，如Npt-Ⅱ基因，可赋予转化植物细胞卡那霉素抗性；⑤它应该含有单一的限制性内切酶切点，以利于外源基因的插入；⑥无Ti质粒的边界序列。a.中间载体必须有T-DNA的同源序列，还有pBR的序列，进入农杆菌后高频同源重组b.要有细菌选择标记基因，便于筛选共整合质粒c.阳性的植物选择标记基因d.单一的限制内切酶切点，多克隆位点e.无Ti质粒的边界序列f.要有bom位点序列，可以在不同细菌细胞间转移二. 植物病毒载体系统 1.RNA病毒作为基因载体的基本方法①单链病毒RNA反转录成一条单链cDNA（ssDNA）；②合成双链cDNA（dscDNA）；③双链cDNA在细菌质粒或Cosmide中克隆；④外源基因插入到克隆质粒的cDNA中； ⑤把带有外源基因的cDNA转录成RNA再感染植物。 3. 病毒载体系统的评价优点：①感染方式简单（CaMV，TMV）；②可以产生系统感染③外源基因拷贝数大