藻蓝蛋白实验报告.doc

藻蓝蛋白的分离与纯化 姓名：郭均 学院：食品与生物工程 班级：食安 09-2 学号：200906041069 藻蓝蛋白的分离与纯化 实验目的和要求 1、了解藻蓝蛋白的生理意义及功能，藻蓝蛋白的一般提取和纯化的方法； 2、掌握蛋白含量测定方法； 3、掌握盐析和离子交换层析纯化蛋白的分析技术。 二、实验原理 藻蓝蛋白（PC）Ph6.5的磷酸盐缓冲液10ml，充分搅拌均匀。室温浸泡30min-1h后，在-20℃和38℃之间反复冻融数次（3-5次）。细胞破碎后，将悬浮液移入离心管，加入10mL 0.01mol/L Ph6.5的磷酸盐缓冲液，混匀，静止30min，4000r/min离心20min，上清液即为抽提得到的藻蓝蛋白混合液。 2、分步盐析：采用不同浓度的硫酸铵分步盐析初步纯化出藻蓝蛋白。 具体操作：取上清液，用25%饱和度的硫酸铵4℃ 盐析30min，然后4000r/min离心20min，所得上清液用55%饱和度的硫酸铵4℃盐析24h，4000r/min离心20min，弃去上清液，离心收集得到的沉淀即为藻蓝蛋白。 3、透析去盐 得到的沉淀用10ml 0.01mol/L Ph6.5的磷酸盐缓冲液溶解，然后将藻蓝蛋白粗提液置于透析袋（截留分子质量为10kD）Ph6.5的磷酸盐缓冲液（或H20）中透析袋中倒出纯化后的藻蓝蛋白，于4℃下保存备用。 （二）藻蓝蛋白含量测定 1、制作标准曲线； 2、样品含量测定； 3、计算结果。 具体操作步骤如下： 取洁净干燥的试管若干，按表1-1比例配置标准蛋白溶液。原始标准蛋白的浓度为0.1mg/mL。 表1-1 标准溶液配置 管号 1 2 3 4 5 6 标准蛋白（mL） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水（mL））Ph6.5的磷酸盐缓冲液平衡。 将初步纯化得到的藻蓝蛋白液上DEAE-纤维素柱，采用0.01mol/L Ph6.5的磷酸盐缓冲液洗脱（含0.4mol/L NaCL）进行洗脱，柱上层的深蓝色部分大多被迅速洗脱下来，只残留少量蓝色。流速控制在10d/min，用小试管收集洗脱液，每管收集2mL（或30滴），收集10-12管（呈现蓝色的液体内含有目的蛋白）。测定每管样品的A620，横坐标洗脱体积、纵坐标A620值，绘制洗脱曲线。合并所有的管中的样品，A620和A280值，计算纯度。（注意：开始洗脱时就需要收集洗脱液，测量洗脱液体积，用于绘制洗脱曲线） 然后用0.01mol/L Ph6.5的磷酸盐缓冲液（含0.6mol/L NaCL）洗脱，洗脱下的是别藻蓝蛋白。 柱料的再生：用0.5ml/L HCL溶液处理柱料，洗2-3倍柱床体积，用H20洗至pH6.0，0.01mol/L Ph6.5的磷酸盐缓冲液平衡。 五、数据处理和实验结果 1.标准曲线的绘制 表1-2 标准蛋白溶液吸光度 管号 1 2 3 4 5 6 标准蛋白（mL） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水（mL） 吸光度（A595） 0.000 0.201 0.414 0.484 0.661 0.740 所测样品吸光度A595= 0.706，可推算出样品中藻蓝蛋白含量m = 0.917 g 2.洗脱曲线的绘制 表 1-3 柱层析洗脱液吸光度 试管编号 1 2 3 4 5 6 7 A620 0.002 0.005 0.093 0.251 0.381 0.224 0.132 试管编号 8 9 10 11 12 13 A620 0.081 0.052 0.052 0.029 0.008 0.009 3.藻蓝蛋白纯度计算 盐析后蛋白纯度 = A620/A280 = 0.385 / 0.517 = 0.745 柱层析后蛋白纯度 = A620/A280 = 0.226 / 0.103 = 2.194 4.回收率和纯化倍数计算 蛋白得率 =　盐析后蛋白含量/ 1g 藻粉 = 0.917 / 1.00 = 91.7% 纯化倍数 = 柱层析后蛋白纯度/ 盐析后纯度 = 2.194 / 0.745 = 2.94 六、思考题 1. 蛋白含量测定的方法有哪些？各有什么特点？ （1）.凯氏定氮法：是测定试样中总有机氮最准确和最简单的方法之一，被作为法定的标准检验法。适用范围广泛，测定结果准确，重现性好，但操作复杂费时，实际消耗量大。 (2). 双缩脲法：试剂单一，方法简便，但灵敏度差，测定范围为1~20mg蛋白质。适用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白测定，常用于谷物蛋白的含量测定。 (3).紫外吸收法：简单灵敏快速，不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定，测定后仍能回收使用。但准确度较差，干扰物质较多，适用于与