第一章 蛋白质的表征.pptxVIP

第一章 蛋白质的表征;第一节 蛋白质结构的基本概念; 除了列出的20种基本氨基酸外，实际上 还有几百种不常见的氨基酸参及某些蛋白质 的组分，可称为稀有氨基酸；另一些氨基酸 出现频率要高些，如羟脯氨酸、甲基组氨 酸和甲基赖氨酸、丁—羧基谷氨酸等，但它 们是在蛋白质生物合成后转变而来的，因此 不计入基本氨基酸之列。; 这是一个链状的结构，经水解后，将肽 键断裂，转变成一系列的氨基酸。链中相当 于氨基酸的单元结构称为残基。而上述链称 为肽链。肽链的氨基一端称为N端或氨基端， 羧基一端称为C端或羧基端。习惯上将N端列 在左边，C端列在右边。 ; 从氨基酸的结构看，半胱氨酸的侧链上有巯基(一SH)。巯 基的稳定性较差，在碱性pH下易氧化成二硫键。如果一条肽 链上的两个半胱氨酸的巯基形成二硫键，肽链形成链内二硫 键。假如两条肽链间形成二硫键，就出现由两条肽链组成的 蛋白质(如胰岛素)。蛋白质分子有两对以上的二硫键，或者 是蛋白质分子有一对二硫键和一个半胱氨酸，二硫键可能有 不同的连接方式，于是出现了异构体。异构体的数目因半胱 氨酸含量不同而异，但是在天然的蛋白质分子中没有这种异 构体，只有一种连接方式。而在重组蛋白质的复性中，可能 出现二硫键的错配对。 ; 一级结构是指肽链中的氨基酸排列序列，二硫键的定位也是一级结构 的重要内容。 蛋白质的二级结构也可称为构象单元，因为它们是蛋白质复杂的空间 构象的基础。一些构象单元的结构不是不可改变的，pH、温度、溶剂极 性等环境因素可以影响单元的变化。 具有二级结构的肽链在空间走向，形成具有空间三级结构的蛋白质， 如所谓球蛋白类，它们几乎都有生物功能和活性，其中有些还能进一步 相互作用，形成更高层次的结构。蛋白质之所以有功能，是因为分子表 面有可以进一步作用的基团，不同的蛋白质由于分子表面结构不同，可 作用的基团分布和组合也不同，这种特定的结构就是各种蛋白质具有不 同的功能和活性的分子基础。 四级结构可以认为是一些特定三级结构的折叠肽链通过非共价键而形 成的大分子体系，也可称为亚基的装配(assembly)。装配是一个非常复 杂的过程，它能使各亚基间相互调节，使蛋白质分子的功能更完善。 ; 蛋白质的分离纯化是研究蛋白质的基础和起点。蛋白质的来源是多样 的，主要来自动物、植物的各种组织和微生物，取材要采用含量丰富的 器官。 抽提蛋白质的第一步是将组织粉碎，破坏细胞，以便于抽提出蛋白 质；抽提液的选择也因蛋白质而异。一般用低浓度的缓冲液，有时在从 肌肉抽提时也用稀碱，因肌肉中含有乳酸，最后抽提液的pH却是中性 的。在提取膜蛋白或包含体内的蛋白质时，还加入(非离子型)表面活性 剂或变性剂以增加溶解度。各种细胞中普遍存在各种蛋白水解酶，会导 致蛋白质的降解，低温操作和加一些相应蛋白酶抑制剂(如DFP、 PCMB、PMSF等)、螯合剂(EDTA等)是有益的。 将蛋白质抽提出来后，就要进一步纯化。纯化不外乎两方面：一是将 大体积变成小体积；二是把多组分蛋白质只留下单一种的蛋白质。前者 有吸附法、超滤法、冻干等。后者有根据蛋白质的分子形状和分子质量 大小、电离性质、溶解度和疏水性、生物功能专一性等，常用有各种盐 析法、超离心沉降、结晶、电泳、凝胶过滤，离子交换色谱、亲和色谱 等。近年来发展的FPLC和HPLC大大促进了许多蛋白质在毫克级的纯 化，其量足够用于蛋白质的化学研究。;第二节 蛋白质的纯度; 目前常用的鉴定蛋白质纯度方法有： ①聚丙烯酰胺凝胶电泳和十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶 电泳(SDS)； ②毛细管电泳(CE)； ③等电聚焦(IEF)； ④高效液相色谱(HPLC)，包括凝胶过滤、各种反相色谱、 离子色谱、疏水色谱等； ⑤质谱(MS)。 一些新的有效方法也在引入分析蛋白质的纯度，如质谱 等。由于它测定分子质量的精确度可达万分之一，因此丢失 一个氨基酸残基(平均分子质量约110Da)就可以检出；如有 氨基酸的取代形成突变株(可能分子质量有几十道尔顿的差 异)，也非常容易被发现。; 按照严格的要求，用电泳法证明蛋白质的纯度， 在一种pH下电泳说明该蛋白质是纯的，这是不够充 分的。应该取两种pH缓冲液，它们分布在蛋白质等 电点的两侧，在这两种pH下电泳都证明此蛋白质是 纯的，这样才可靠。 应该指出，只用一种方法鉴定蛋白质纯度是不够 的，至少应该用两种以上的方法，而且是两种不同 的分离机理的方法来判断蛋白质纯度才比较可靠。 因为常常发现某一样品在凝胶过滤中是纯的，而在 离子色谱中却分辨为两个组分，反之亦然。 又如，一种样品用凝胶过滤法和SDS—PA