3. 总RNA及提取,电泳鉴定及RT-PCR.pptVIP

思考题： PCR反应的第几个循环开始出现符合预期长度的目的DNA片段？请画图说明。 用Taq DNA聚合酶进行PCR时，获得的PCR产物的末端都有哪些情形？T-A连接的原理是什么？影响连接效率的因素有哪些？ 实验结束后整理实验台, 值日生值日! * 如果采用底部加热的方式，将会造成管内液体的蒸发，严重影响反应体系的准确性！ 一般说来，基因片段的长度为750 bp左右时， 通常可按下列条件进行PCR： * 1. 琼脂糖凝胶电泳原理 在 pH 8.0 的电泳环境中， DNA分子由于含有大量的磷酸基团而带负电荷。因此，在一定强度的电场中，带负电荷的DNA会从负极向正极迁移。 用于制备电泳凝胶的琼脂糖是一种线性多糖聚合物，煮沸冷却后形成样结构，电泳中起分子筛作用。 通常情况下，分子量大的DNA电泳过程中由于受到凝胶网格的阻力较大，泳动速率较慢; 反之，分子量较小的DNA片段在琼脂糖网格中收受到的阻力较小，因此泳动速率较快,跑在前面。 * 实验二、 RNA提取及RT-PCR 实验内容 1、小鼠肝脏组织总RNA的提取 2、RNA的琼脂糖凝胶电泳 3、以RNA为模板进行RT-PCR 4、 PCR产物的电泳及回收 实验一. 提取小鼠肝脏组织的RNA 一、真核细胞的总RNA 1、mRNA: 1-5% 5`鸟嘌呤7位甲基化—CH3修饰。 1）免受核酸酶破坏， 2）起始、促进蛋白质合成。 3`poly(A)尾巴结构 20--200个A. 翻译所必需。 起始密码：AUG 终止密码：UAA,UAG,UGA。 2、tRNA: 10-15% 3、rRNA: 80-85% 大亚基60S: 28S=4718nt 5S=120nt 5.8S=160nt 小亚基40S: 18S=1874nt 二、RNA提取的注意事项 RNA酶：广泛存在：灰尘、人体唾液、实验器材表面。 生物活性非常稳定：耐热、耐酸、耐碱。 1、 尽量避免外源性RNase 污染 A. 操作环境空气洁净。带手套、口罩。 B. 用新开封的化学试剂。（试剂应该专用） C. 一次性塑料器材最好是新开封， (DEPC水处理后）高压灭菌。 D. 玻璃器材、水都应该经过去RNase 处理。 对玻璃器材还应该进行高温烘烤。 2、抑制内源性RNase 活性： RNase 抑制剂。 RNA分离的关键因素：避免RNA酶的污染。 1)发放口罩，帽子，每个组来一个人领取。 将1 mL Trizol 试剂移入Eppendorf管中。 2)实验教师操作: 取新鲜小鼠肝脏组织，组织块不宜过大, 放在玻片上立即研磨,研磨要彻底。 3)将研磨后的组织(小米粒大小)转移至1 mL Trizol 试剂中，盖紧盖，上下颠倒混合2 min以上。使组织细胞充分裂解。肉眼观察可见液体变成均匀浑浊状。 4)室温孵育10 min。 三、RNA提取的实验操作 播放有声课件1: RNA提取方法及注意事项 1、异硫氰酸胍法： GuSCN 是一种强的蛋白质变性剂，能够裂解细胞的同时，还能有效地抑制内源性 Rnase的活性，通过有机溶剂的分步抽提，可获得纯度较高的细胞总RNA。 特点：需低温操作，但价格经济。 2、Trizol 试剂（商品化产品） 特点：在室温下可以提取细胞总RNA， 简单、快速、提取量大、纯度高。 3、mRNA提取试剂盒 真核细胞mRNA的3末端有ploy(A)尾，利用寡聚 dT纤维素结合mRNA，将其从细胞总RNA中分离出来。 RNA提取的几种方法 室温孵育10