lab-6血清抗体及分离与纯化.pptVIP

一 教学要求 多克隆抗体血清含有多种蛋白质组分，不适用于实验室分析、检测应用。根据实验目的不同，可按照不同的方法对有效的抗体成分进行分离、纯化。 如作为ELISA检测时的抗体，部分情况下饱和硫酸铵纯化即可。 免疫放射测定的标记用抗体必须达到双级纯才可应用（亲和层析+SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳纯）。 二 实验原理 常用盐析法、凝胶柱层析、离子交换剂层析以及免疫亲和层析等技术对血清抗体进行分离纯化。 盐析法原理 水膜与同性电荷的排斥作用是蛋白质胶体稳定的基础，在蛋白质胶体溶液中加入一定量的（NH4）2SO4或Na2SO4盐类，使溶液中大部分自由水分子转变为离子水化分子，降低蛋白质极性基团与水分子的相互作用，破坏蛋白质水膜，蛋白质溶解度也随之降低。蛋白质由于分子质量和携带的电荷不同，可在不同浓度的高盐溶液内分级析出。33% （NH4）2SO4为沉淀IgG的最适饱和度。 离子交换层析原理 利用蛋白质的酸碱性质，使蛋白质混合物与离子交换纤维素的酸性基或碱性基相结合。由于盐类的存在可以降低离子交换剂的离子基团和蛋白质的相反电荷基团之间的静电相互吸引，通过改变溶液中盐类离子强度和PH可以将蛋白质分离。层析血清IgG的常用纤维素为DEAE-32 免疫亲合层析法 采用化学方法将抗原或抗体偶联到固相载体上，使之成为不溶性结构。再经层析法吸附液体中的相应抗体或抗原，成为抗原抗体复合物。然后改变条件，使该免疫复合物解离，洗脱得到纯化的相应抗体或抗原。 目前，普遍采用的方法是将硫酸铵盐析与DEAE-32离子交换柱层析法结合起来，即先采用2步硫酸铵盐析法粗提，再经离子交换柱层析得到较纯的IgG 三 材料与器材（略） 四 操作步骤 　　　　　 免疫血清 1 mL 　　　　↓加 1mL 生理盐水 逐滴加入饱和（NH4）2SO4 2 mL（此时为50%饱和度） 4℃，静置 20 min↓3000 r/min 离心 20 min 　　　取沉淀溶于 2 mL 生理盐水中 　　　 ↓ 逐滴加入饱和（NH4）2SO4 1 mL（此时为33%饱和度） 4℃，静置 20 min↓3000 r/min 离心 20 min 　 取沉淀溶于0.5 mL 生理盐水中 　 ↓ 　　 装入透析袋 　　　 ↓ 对0.0175mol/L pH 6.3 PB透析1d，其间换液6次 ↓ DEAE纤维素层析 ↓ 将蛋白含量高的收集管内液合并，测蛋白含量 （mg/mL)并进行纯度鉴定 五 注意事项 （1）.盐析时注意饱和硫酸铵加入血清中的速度和方式，边加边缓慢摇动，并避免产生气泡。 （2）.注意区别前后2次盐析所采用的饱和硫酸铵的终浓度。 （3）.注意检查层析住的情况，主要明确层析住是否均匀，表面是否平整，有无气泡、裂隙。 六 思考题 （1）记录个管收集样品的OD值，并绘制洗脱曲线 （2）对IgG的含量和纯度结果进行分析。 （3）探讨影响IgG纯度的因素 * * 实验六 血清抗体的分离与纯化