基因工程—工具酶中国药科大学生物工程所有课件.ppt

第二节 基因工程的工具酶 一、细菌的限制—修饰作用和限制性内切酶的发现 即限制性内切酶和与其对应的甲基化酶系统，称R-M system 限制性内切酶识别特异的DNA序列并打断DNA，同时对应的甲基化酶能把该段特异的序列甲基化，使得限制性内切酶无法识别。 这种系统在细菌中起到了免疫的作用，即外来入侵的DNA在限制性内切酶的作用下被水解，而细菌自身的DNA在甲基化酶的作用下被保护起来。 1. 来源 （1）限制（Restriction） （2）修饰（Modification） 三、限制性内切酶的命名 四、限制性内切酶的类型 1. I类限制性内切酶 （2）切割位点 I类酶与DNA识别位点结合依赖于M亚基与辅助因子S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的相互作用，后者通过变构作用使酶处于活性状态。 酶分子与识别位点结合之后，根据该位点的甲基化状态发挥相应的酶活性，或限制、或修饰、或既不限制也不修饰。 I类酶的切割位点与识别位点通常相距1,000-5,000bp，切割位点的序列并不表现出严格的特异性，两条DNA链上的断裂位点相距70-75个核苷酸，因此切开的DNA分子末端是单链形式。 II类限制性内切酶 绝大多数的II类酶均在其识别位点内切割DNA，切割位点可发生在识别序列的任何两个碱基之间。一部分酶识别相同的序列，但切点不同，这些酶称为同位酶（Isoschizomers），其中识别位点与切割位点均相同的不同来源的酶称为同裂酶，如SstI与SacI、HindIII与HsuI等。有些酶识别位点不同，但切出的DNA片段具有相同的末端序列，这些酶称为同尾酶（Isocandamers）。 根据被切开的DNA末端性质的不同，所有的II类酶又可分为5’突出末端酶、3’突出末端酶以及平头末端酶三大类。 （2）切割位点 （3）粘性末端（sticky ends，cohensive ends） ② 3’端凸出（如Pst I切点） （4）粘性末端的意义 ② 5’末端标记 （5）同裂酶（Isoschizomers) ② 不完全同裂酶： （6）同尾酶(Isocaudamers） （7）限制酶的酶活性 较高的甘油浓度（5% v/v）； 酶与底物DNA比例过高（不同的酶情况不同，通常为100 U/μg）； 低盐浓度（25 mM） 高pH值（pH 8.0） 存在有机溶剂（如DMSO、乙醇(9)、乙烯乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、sulphalane(12)等） 用其他二价离子替代镁离子（如Mn++，Cu++，Co++，Zn++等） 以下酶类易出现“星号活性”，它们是 BamH I，Bcl ?I，BseB I，BssA I，EcoRI，EcoR V，Hind III，Hpa I，Kpn ?I，NcoI， NruI，Pst ?I，Pvu II，Sal I，Sca I，SnaB I，Sph I，Ssp I，Xba I。 尽量用较少的酶进行完全消化反应。这样可以避免过度消化以及过高的甘油浓度。 尽量避免有机溶剂（如制备DNA时引入的乙醇）的污染。 将离子浓度提高到100-150 mM（若酶活性不受离子强度影响）。 将反应缓冲液的pH值降到7.0。 二价离子用Mg++。 （8）Ⅱs型限制性内切酶 3. III类限制性内切酶 III类限制-修饰酶由R亚基和MS亚基组成，其中MS亚基具有位点识别和甲基化修饰双重活性。 该类酶与DNA识别位点的结合严格依赖ATP，在与识别位点结合之后，修饰作用与限制作用取决于两个亚基之间的竞争。修饰作用在识别位点内进行，甲基化受体是腺嘌呤碱基，供体仍为SAM。 切割位点位于识别位点一侧的若干碱基对处，但无序列特异性，只与识别位点的距离有关，而且不同的III类酶具有各自不同的距离，从7至26bp不等。 五、影响限制性内切酶活性的因素 2. DNA的甲基化程度 3. 温度 4. 缓冲液(Buffer) 六、限制性内切酶对DNA的消化 2. 完全消化 3. 局部消化 4. 限制酶酶切反应的终止 要做定向克隆，通常要作双酶切。同步双酶切是一种省时省力的常用方法。选择能让两种酶同时作用的最佳缓冲液是非常重要的一步。 酶切所用的缓冲液可以从各公司的酶活性图表中选择。 双酶切注意事项 由于内切酶在非最佳缓冲液中进行双酶切反应时，反应速度会减缓，因此需要增加酶量或延长酶切时间来提高酶切速率。 第二节 DNA 连接酶 DNA连接酶旧称“合成酶”。 是1967年在三个实验室同时发现的，最初发现于大肠杆菌。它是一种封闭DNA链上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5‘-PO4与另一DNA链的3’-OH生成磷酸二酯键。但这两条链必须