实验凝集反应ELISA备课.pptVIP

* 免 疫 学 实 验 课贵阳医学院免疫学教研室 * 1、试管凝集反应（示教） 2、ABO血型鉴定--玻片凝集反应（1份/1人） 3、乙型肝炎病毒表面抗体检测--ELISA法(1份/1人） 实 验 内 容 * 实验二 凝 集 反 应（Agglutination） * 实验原理 颗粒性抗原（细菌、细胞等）与相应的抗体，或可溶性抗原/抗体吸附于与免疫无关的载体，形成致敏颗粒，与相应抗体/抗原在一定的条件下，形成肉眼可见的凝集小块的反应，称为凝集反应。参与反应的抗原称凝集原（agglutinogen），抗体称为凝集素（agglutinin）。 * 凝集反应类型 直接凝集反应（direct agglutination） 颗粒性抗原与相应抗体直接结合，所出现的凝集现象，包括试管凝集反应、玻片凝集反应。 间接凝集反应 （indirect agglutination） 将可溶性抗原（或抗体）吸附在与免疫无关的载体颗粒表面，使此形成致敏颗粒，然后再与相应抗体（或抗原）混合，在适当条件下，发生凝集现象，称为间接凝集反应或被动凝集反应。 * * 操作步骤 于试管架上列7支试管。 1.每管内分别加入生理盐水0.5ml。 2.血清稀释：第一管加入1:10待检血清0.5ml，混匀 后取0.5ml，加入第二管内，依此类推，直到第6管， 混匀后从第6管中吸出0.5ml弃去；第7管为对照管。 0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml （一）试 管 凝 集 反 应 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 * 3.每管加伤寒杆菌“H” 抗原0.5ml。 4.混匀，置 52℃水浴4h，取出后，置 室温过夜，次日读取凝集效价。 * 结 果 观 察 不同程度的凝集现象： ＋＋＋＋：液体澄清，细菌全部凝集（100%），沉于 管底形成大片凝集物。 ＋＋＋： 液体基本澄清，细菌大部分凝集（75%左右），管底的凝集物稍小。 ＋＋： 液体半澄清，稍显浑浊（凝集物50%左右），但仍可见明显凝集块。 －： 液体浑浊，无凝集块，轻摇试管，有细菌呈 线状浮起。 * 效价：抗原抗体反应时，发生明显反应的最高血清稀释度，又称滴度。 凝集效价：凝集反应时，能使50%或以上的抗原发生凝集的最高血清稀释度。 * （二）玻片凝集反应 已知抗血清与未知颗粒性抗原置于清洁玻片上，在一定的条件下，若两者相对应，则会发生凝集。本方法主要用于抗原的定性分析，如菌种鉴定、ABO血型鉴定等。 ABO血型系统 * * ABO血型鉴定步骤 红细胞悬液的制备（用于血型鉴定及ELISA实验） 1. 取EP管1支，加入5滴生理盐水 2. 消毒耳垂或手指皮肤 3. 用采血针采1-2滴血，加入盛有生理盐水的EP管中混匀 4. 2000rpm，离心3min 5. 取红细胞悬液用于ABO血型鉴定 6. 取已加有抗A血清与抗B血清载玻片1张，分别加入待测抗原各1滴，并用牙签混匀。 7. 置室温5 分钟左右观察结果。 取上清用于ELISA实验 ABO血型鉴定的判断 B型 抗A型标准血清 抗B型标准血清 抗A型标准血清 抗B型标准血清 A型 抗A型标准血清 抗B型标准血清 O型 抗A型标准血清 抗B型标准血清 AB型 示 意 图 * 注意事项 用牙签研磨时，注意防止将抗A血清带到抗 B血清中，反之亦然。 如果凝集现象不太明显时，可用显微镜观察。 * 免疫标记技术 将已知抗体或抗原标记上易示踪物质（如酶、荧光素、放射性同位素、胶体金等），通过检测标记物来反映有无抗原抗体反应，从而测出微量的抗原或抗体。 * 实验五 酶联免疫吸附试验（Enzyme Linked Immunosorbsent Assay,ELISA） 【原理】 利用标记技术将酶标记到抗体（抗原）上，使待检物中相应的抗原（抗体）与酶标记抗体（抗原）发生特异性反应。在遇到相应的酶底物时，酶分解底物，生成有颜色的产物。根据颜色的深浅,可以判断待检物中有无特异的抗原（抗体）以及量的多少。检测方法有直接法、间接法、双抗体法和抗原竞争法。 * 直接ELI