实验血清脂蛋白琼脂糖凝胶电泳分析.pptVIP

血清脂蛋白琼脂糖凝胶电泳分析 【目的要求】 1.掌握琼脂糖凝胶电泳分离血清脂蛋白的 原理,掌握正常人血浆脂蛋白的分类。 2.熟悉琼脂糖凝胶电泳的特点和操作要点。 3.了解电泳带中脂蛋白显色特点 【实验原理】 琼脂在化学上是由琼脂糖和琼脂胶组成的复合物，为一种含硫酸根、带负电荷的多糖类物质。琼脂是直链多糖，它由D-半乳糖和3，6脱水L-半乳糖的残基交替排列组成。 琼脂糖主要通过氢键形成凝胶。电泳时，因为凝胶中含水量大（98～99%），近似自由电泳，固体支持物的影响较少，故电泳速度快、区带整齐。而且由于琼脂糖不含带电荷的基团，电渗影响很小，是一种良好的电泳材料，分离效果较好。 血清中脂类物质均与载脂蛋白结合成水溶性脂蛋白形式存在。各种脂蛋白所含载脂蛋白的种类及数量不同，因而不同脂蛋白颗粒大小相差很大。因此，以琼脂糖凝胶为支持物，在电场中可使各种脂蛋白颗粒分开。 琼脂糖凝胶电泳分离血清脂蛋白方法简单。将血清脂蛋白用脂类染料苏丹黑（或油红等）进行预染。再将预染过的血清置于琼脂糖凝胶板上进行分离。通电后，可以看到脂蛋白被分成三条区带，从负极到正极依次为β脂蛋白（最深）、前β脂蛋白（最浅）及α脂蛋白（比前β脂蛋白略深），在原点处应无乳糜微粒。 【实验器材】 1.电泳仪、电泳槽 2.载玻片 3.台式离心机 【实验操作】 1.预染血清? 血清0.2ml中加苏丹黑色液0.02ml，混合置37℃水浴中染色30分钟，离心（2，000转/分）5分钟。 2.制备琼脂糖凝胶板? 将已配制好的0.50%琼脂糖凝胶于水浴中加热融化，用吸管吸取约3ml凝胶溶液浇注在载玻片上，立即放上“桥”，静置待其凝固后，小心取下“桥”。 3.电泳? 将凝胶板平行放入电泳槽中，加样孔端置负极。用四层滤纸于巴比妥缓冲液浸湿，然后轻轻盖贴在凝胶板两端，滤纸的另一端则浸于电泳槽内的巴比妥缓冲液中。接通电源后低压加样，加样完后电压调为120～130V。经电泳35～50分钟，即可见到分离的区带。 4.如果需要保留电泳图谱，可将电泳后的凝胶板放入干胶机中制成干胶片。若无干胶机，可用玻璃纸包好凝胶板（连同载玻片），其上平铺多层吸水滤纸，滤纸上再压上书等重物，吸干凝胶中的水分。也可将凝胶板先放入清水中浸泡脱盐2小时，然后放烘箱（80℃左右）中烘干，但应陋随时注意温度的变化以及凝胶的脱水程度，以避免凝胶在脱水过程中龟裂。 【注意事项】 1.预染血清与温度有关，低温着色慢，高温着色快，37℃较为适宜。 2.浇注琼脂糖凝胶板要尽量使厚薄均一，否则会影响脂蛋白的分离效果。 3.将凝胶板放入电泳槽中，应切记与电力线平行、样品端置负极、搭桥滤纸不能搭在样品上。 4.制备干胶时，要严控制脱水的温度和速度，避免脱水时温度过高、速度太快引起凝胶收缩龟裂。 【思考题】 1.琼脂糖凝胶电泳有哪些操作要点？ 2. 在不同的实验方法（超速离心、琼脂糖凝胶电泳、PAGE）中，正常人血清脂蛋白如何分类，电泳后的相对位置及其与超速离心法的对应关系？ 3.各种脂蛋白的功能？为什么正常人血清脂蛋白电泳时见不到乳糜微粒区带？ 【正常参考值】 乳糜微粒（CM）? 0～0 % ? β－脂蛋白（β-LP）（LDL为主）? 50～60 % ? 前β－脂蛋白（Pre β-LP）? 13～25 % ? α-脂蛋白（α－LP）（HDL为主）? 20～40 % * *