崔福爱实验葡聚糖凝胶分离蓝葡聚糖和溴酚蓝.pptVIP

实验二 葡聚糖凝胶分离蓝葡聚糖和溴酚蓝 崔 福 爱 生化与分子生物学研究所 实验目的 1 ．掌握生化分离技术——层析技术的基本原理。 2．掌握葡聚糖凝胶的特性及凝胶层析的原理。 3．学习葡聚糖凝胶层析的基本操作技术（凝胶处理、装柱、平衡、上样、洗脱、收集、检测）。 层析法 层析法也称色谱法，是一种广泛运用的物质分离纯化、分析鉴定技术。 1903年俄国植物学家Michael Tswett发现并命名的。将植物色素溶液通过装有CaCO3 吸附剂的柱子，然后用石油醚淋洗，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开。 用色彩（chroma）和 图谱（graphs）组成 色谱一词 （Chromatography) 依据： 混合物中各组分的理化性质差异—— 吸附力、分子形状、大小、酸碱性或分子极性、分子亲和力以及分配系数 最终达到对物质进行分离纯化和分析鉴定的目的。 基本原理：固定相和流动相 固定相 —— 固定不动流动相 —— 对固定相作单向相对运动，推动样品中各组分通过固定相向前移动。 各组分理化性质不同，对流动相和固定相具有不同的作用力，因此在流动相推动样品通过固定相的过程中，通过不断地吸附、解吸、吸附、解吸作用，造成混合物中各组分在固定相中的迁移距离不等，达到分离。 分类：①流动相的物理状态：气相和液相②方式：纸、薄层、柱③原理：吸附、分配、凝胶、离子交换、亲和、金属螯合、疏水、反相 凝胶层析(Gel Chromatography) (凝胶过滤、凝胶色谱、分子筛层析、分子排阻层析) ①定义：指混合物随流动相流经固定相的层析柱时，混合物中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。 ②基本原理： 固定相：凝胶，惰性三维空间多孔网状结构，故称分子筛，包括琼脂糖、交联葡聚糖、聚丙烯酰胺、琼脂糖-葡聚糖复合凝胶。 流动相：洗脱液 交联葡聚糖凝胶 多聚葡萄糖与环氧丙烷交联而成，网状结构球状颗粒，商品名为Sephadex G系列 G—交联度：G后面的阿拉伯数字表示不同的规格型号，有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150和G-200八种，具体含义为吸水量（g）/10g干胶。 交联度与孔径大小成反比：交联度越大（G小），孔径越小，吸水性小；交联度越小（G大）， ，孔径越大，吸水性大。因此，“G”反映凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围。 凝胶层析的基本原理 样品加于柱上，样品随洗脱液的流动而向下移动，同时作垂直向下运动和不定向扩散运动→小分子可进入凝胶空内部，流程长，速度慢，后流出；大分子不能进入凝胶空内部，颗粒间移动，流程短，先流出→大小分子彼此分开 。 ③影响因素 层析柱的选择及装填： 柱大小—分离样品量 凝胶型号—分辨率：各种分子筛的孔隙大小分布有一定范围，有最大极限和最小极限。凝胶分离范围之外的分子，难以分离。如大小不同的两种全排阻分子/完全渗透分子。 洗脱液：溶解待分离物质，不变性 加样量：1%～5% 凝胶的再生 实验原理 本实验以葡聚糖凝胶G-25作为固定相载体，来分离蓝色葡聚糖-2000和溴酚蓝。 蓝色葡聚糖-2000分子量接近2×106，而溴酚蓝分子量为669，二者分子量相差较大。两者混合物加到葡聚糖凝胶层析柱，利用缓冲液洗脱，在洗脱过程中，大分子的蓝葡聚糖不能进入凝胶网孔，而沿凝胶颗粒间隙直接先流出柱外；小分子的溴酚蓝可完全进入凝胶网孔内，流速缓慢，后流出柱外，二者通过层析柱的时间不同而分开。 实验方法 1. 凝胶的选择和处理：用蒸馏水把凝胶充分膨胀，把杂质漂洗干净。 2. 装柱： ⑴ 将层析柱垂直夹于铁架上，先加入蒸馏水10ml，打开柱下端的螺旋夹，使蒸馏水下流至剩余高度约2-3cm时关闭出口，以排除底部气泡。 ⑵ 将膨胀好的凝胶边搅拌边连续加入层析柱中，灌注高度为10-12cm。 ⑶ 用螺旋夹控制流速为20-40滴/分钟，用