引物设计和酶切位点分析.PPT

引入酶切位点引物设计 为什么要引入酶切位点？ 突变位点没有内切酶或者合适的内切酶 通过人为的在引物上改变一个碱基从而使之与突变位点的碱基构成新的酶切位点 引入酶切位点引物设计 tctcaacaaaaTcaaaactgtaag 突变位点，找不到合适的内切酶 tctcaacaGaaTcaaaactgtaag Hinf I 可以使用PCR-RFLP的方法基因分型 引入酶切位点引物设计 基本原则： 人为改变原序列上的一个碱基从而与突变位点的碱基构成新的合适的酶切位点 具体要求： 内切酶的选择：便宜、条件稳定和常用。 引物的位置：引物3’端的最后一个碱基一定不能超过突变位点 改变酶切位点的位置：尽量远离突变位点，最好不要紧邻突变位点，一般相隔2-3个碱基 引物的长度：在保证引物质量的前提下，尽可能的加长引物的长度。最好不要小于20bp 引入酶切位点引物设计 5. PCR产物的长度：最好能位于100-200bp之间，琼脂糖凝胶电泳时更好区分。 6. 突变位点附近的引物设计受限，因此，另外一条引物应该尽量设计好。 7. 在有多种内切酶可供选择时，尽量选择切频率高的基因型的内切酶。以提高灵敏度。 引入酶切位点引物设计 5’ GCCTGGATTCAGAATGATTCTCTTC 3’ 5’ TACTGACCTTCTCGCCAATCTCTGT 3’ 改变位点 引入酶切位点引物设计 5’ TCAGATGACACCTCTCAACAGAA 3’ 5’ CCAGTTTTCACCTCCCACATTAT 3’ 改变位点 5’ TCCTCGTGTGGGTGCCTG 3’ 5’ GACTTACAGTTTTGGTTTTGTTGAT 3’ 改变位点 5’ TCCTCGTGTGGGTGCCAT 3’ 5’ GACTTACAGTTTTGGTTTTGTTGAT 3’ 改变位点 引入酶切位点引物设计 定点诱变引物设计（一） 定点诱变引物设计（一） 定点诱变引物设计（二） 5-ggattcagaatgattctctccaagaaaacatcctttttggatg-3 3-cctaagtcttactaagagaggttcttttgtaggaaaaacctac-5 酶切位点分析 新建窗口 酶切位点分析 输入序列，注意粘贴的序列不能有空格和段落标记符号 大写突变位点以便于辨认 酶切位点分析 选择菜单 Analyze Restriction maping 酶切位点分析 酶谱选择 点击确定 酶切位点分析 可供选择的限制性内切酶 酶切位点分析 酶切位 点个数 酶切位置 酶切后片断大小 电泳 琼脂糖凝胶电泳：操作简便、快捷、灵敏。是分离、鉴定和纯化核酸的首选的标准方法。 聚丙烯酰胺凝胶电泳：分辨力高于普通琼脂糖凝胶电泳，适用于低分子质量蛋白、寡核苷酸的分离和DNA序列的分析。 电泳 琼脂糖凝胶浓度（%） 线性DNA分子大小（kb） 0.3 5-60 0.6 1-20 0.7 0.8-10 0.9 0.5-7 1.2 0.4-6 1.5 0.2-4 2.0 0.1-3 凝胶浓度和DNA分子的有效分离范围 电泳 157bp 132bp 344bp 310bp 相差25bp 相差34bp 结果分析 频率统计 H-W平衡分析 统计检验 最终结果 祝大家实验顺利 如何预知我的SNP的功能意义 如何预知我的SNP的功能意义 如何预知我的SNP的功能意义 结构域 名称 起止氨基酸编号 该结构域的氨基酸长度 如何预知我的SNP的功能意义 多态性 包括SNPs 定点诱变研究 氨基酸的改变 是否有功能意义 基因序列查找 更多序列查找方法、查找途径、数据库信息和序列比对 请参考 引物设计 引物设计 引物一般原则 基本原则： 1. 引物要跟模板紧密结合， 2. 引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹结构存在， 3. 引物不能在别的非目的位点引起DNA聚合反应（即错配）。 需要考虑的因素： 引物长度（primer length）、 产物长度（product length）、 序列Tm值(melting temperature)、 ΔG值(internal stability)、 引物二聚体及发夹结构（duplex formation and hairpin） 错误引发位点（false priming site）、 引物及产物GC 含量（composition） 引物一般原则 引物的长度：15-30bp，常用的是18-27bp 太短：特异性不好 太长：延伸温度大于Taq酶的最适温度 引物末端要求：3’端的序列要比5’端重要， 引物3’端的碱基一般不用A A在错误引发位点的引发效率相对比较高 ，