游动双孢菌线型质粒pPR2的全序列测定及分析.docVIP

ISSN 0001-6209; CN11-1995/Q 游动双孢菌线型质粒pPR2的全序列测定及分析杨勇，覃重军中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所上海 200032摘要：全长为15520 bp，G+C）含量为68.1%。其端粒末端反向重复序列长度为329 bp，不能像多数链霉菌的线型质粒那样能形成保守的“折返”的二级结构。pPR2虽然没有链霉菌端粒复制的保守的tap/tpg基因，但是pPR2.3c基因编码了一个双结构域蛋白，分别同链霉菌的端粒复制相关蛋白Tap和嗜血杆菌的解旋酶具有相似性。pPR2缺少典型的链霉菌重复序列-复制基因（iteron-rep）区段，将几乎覆盖全长pPR2的两段DNA进行克隆后，不能转化变铅青链霉菌。此外，pPR2基因还编码可能参与线型DNA复制的调控的单链结合蛋白（SSB）和与放线菌质粒接合转移相关的主要蛋白(Tra)。pPR2是链霉菌之外的放线菌中最小的线型质粒游动双孢菌属线型质粒可能具有新的端粒复制的机制游动双孢菌；线型质粒；全序列；端粒；复制与其它大多数细菌含有环型质粒不同，部分放线菌中含有线型质粒，这其中包括链霉菌属（Streptomyces），红球菌属（Rhodococcus），游动双孢菌属（Planobispora）和分枝杆菌属（Mycobacterium）[1~4]。放线菌线型质粒的长度从12 kb到500 kb不等[5, 6]，而且含有44 bp到180 kb长度不等的末端反向重复序列[7, 8]。这些线型质粒DNA的5′末端通常共价结合有末端蛋白(terminal protein, Tp)[1, 3~9]。放线菌线型复制子（包括线型质粒和线型染色体）结构和功能的研究越来越引起人们的兴趣，其中以链霉菌属研究得最为详细。 链霉菌线型质粒的复制是从一个位于中部的起始位点开始往两端双向复制[10]，最后形成的5末端的缺口被一个由末端蛋白、端粒相关蛋白（telomere associated protein, Tap）及其它相关蛋白组成的端粒结合复合体所延伸补齐[9, 11]。研究表明放线菌线型质粒位于中部的复制起始位点通常由重复序列（iteron）及其附近编码DNA解旋酶[12~15]或未知蛋白[2, 16]的复制基因（rep）组成。 玫瑰游动双孢菌是抗生素GE2270的产生菌，GE2270是翻译延伸因子Tu的一个噻唑基的抑制剂[17]。Polo等人首次在玫瑰游动双孢菌Pbr1435中发现了个线型质粒pPR1（27.5 kb）和pPR2（16 kb），并且克隆和测序了pPR2的端粒[3]。本文对pPR2进行克隆和全序列测定。这是在游动双孢菌属中报道的第一个完整的线型质粒的全序列，分析揭示了pPR2可能的中心复制起始区、端粒复制基因和接合转移基因。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 菌株和质粒：大肠杆菌(Escherichia coli)菌株DH5α和变铅青链霉菌（S. lividans）菌株ZX7为上海植物生理生态研究所分子微生物实验室保存。玫瑰游动双孢菌（P. rosea）菌株Pbr1435（ATCC53733）和Pbr1441由意大利Gianni Dehò教授惠赠。pQC156为鉴定链霉菌复制区的载体，含有可以在链霉菌中选择的硫链丝菌素抗性基因tsr和大肠杆菌氨苄青霉素抗性基因bla。 1.1.2 试剂：所用抗生素氨苄青霉素和硫链丝菌素购于Sigma公司（USA）。所用生化试剂和高保真pfu DNA聚合酶购于上海Sangon公司。所用限制性内切酶和T4 DNA连接酶购于MBI公司。 1.1.3 培养基：大肠杆菌培养基为LB。培养游动双孢菌的固体产孢培养基为R3/1（葡萄糖 10 g，酵母膏 5 g，酪蛋白水解氨基酸 0.1 g，L-脯氨酸 3 g，氯化镁 10 g，氯化钙 4 g，硫酸钾 0.2 g，磷酸二氢钾 0.05 g，TES 5.6 g，琼脂粉 20 g，水 1 L），液体培养基为TSB（tryptone soya broth 30 g，水 1 L）。 1.2 培养和基本的遗传操作 大肠杆菌培养、转化和质粒提取等基本操作见文献[18]。游动双孢菌的线型质粒DNA的提取参照文献[19]。放线菌原生质体的制备及转化参照文献[20]。 1.3 质粒DNA的克隆、序列测定和分析 为了得到全序列，胶回收的pPR2 DNA用EcoRI酶切，所得到的5.0、4.3和5.6 kb的片段克隆到大肠杆菌质粒pSP72的EcoR位点，分别得到重组质粒pQC779、pQC780和pQC782。末端EcoR片段按照Hirochika等人[1]及Shiffman和Cohen[10]的方法用NaOH处理，然后克隆到pSP72的EcoRI-EcoRV位点得到重组质粒pQC77