第五章生物化学实验.pdfVIP

首都师范大学 生命科学学院 生物化学及分子生物学系 2004 年8 月 目 录 实验一 蛋白质的性质实验 3 实验二 蛋白质含量的测定 8 实验三 氨基酸的薄层层析 10 实验四 蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳 13 实验五 酵母RNA的水解及其组成成分的鉴定 18 实验六 细菌总DNA的提取和鉴定 20 实验七 底物浓度对酶促反应速度的影响 23 实验八 pH对酶促反应速度的影响 25 实验九 维生素C含量的测定 26 实验十 葡萄糖氧化酶法测定血糖含量 30 实验十一 血清谷丙转氨酶(SGPT)的测定 31 2 实验一 蛋白质的性质实验 【目的和要求】 1. 学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法及其原理。 2. 了解蛋白质的两性解离性质。初步学会测定蛋白质等电点的方法。 3. 加深对蛋白质胶体分子稳定因素的认识，了解蛋白质的沉淀反应、变性作用的 原理及其相互关系。 【实验原理】 （一）蛋白质及氨基酸的呈色反应 蛋白质所含有的某些氨基酸具有特殊结构，可以与某些试剂反应，生成有色物质。 1. 双缩脲反应 尿素被加热至 180 ℃左右时，两分子尿素缩合放出一分子氨而形成双缩脲。双缩脲 在碱性条件下可与Cu2+ 结合生成复杂的紫红色化合物。此反应称为双缩脲反应。 所有含有两个或两个以上肽键的化合物均有此反应。 蛋白质或二肽以上的多肽分子中，含有多个与双缩脲结构相似的肽键，因此也有双 缩脲反应，可用此法鉴定蛋白质的存在或测定其含量。 2. 茚三酮反应 蛋白质、多肽和各种氨基酸具有茚三酮反应。除无α-氨基的脯氨酸和羟脯氨酸呈 黄色外，其他氨基酸生成紫红色，最终为蓝色化合物。 除蛋白质、多肽和各种氨基酸能进行茚三酮反应外，氨、β-丙氨酸和许多一级胺 化合物都有此反应。该反应灵敏度达 1：1500 000 （pH5-7 ）。现已广泛地用于氨基酸定 量测定。 3 3. 黄色反应 凡是含有苯基的化合物都可与浓硝酸反应产生黄色化合物。芳香族氨基酸及含有酪 氨酸和色氨酸的蛋白质分子具有此反应。苯丙氨酸很难反应，需加少量浓硫酸才有黄色 反应。 (二) 蛋白质的两性反应及等电点的测定 蛋白质和氨基酸一样是两性电解质。调节溶液的酸碱度达到一定的离子浓度时，蛋 白质分子所带的正电荷和负电荷相等，以兼性离子状态存在，在电场内该蛋白质分子既 不向阴极移动，也不向阳极移动，这时溶液的 pH 值称为该蛋白质的等电点(pI) 。当溶 液的pH值低于蛋白质等电点时，即在 H+ 较多的条件下，蛋白质分子带正电荷成为阳 离子，当溶液的pH值大于等电点时，即在OH—较多的条件下，蛋白质分子带负电荷成为 阴离子。 本实验采用蛋白质在不同 pH 溶液中形成的混浊度来确定其等电点，在等电点时 蛋白质溶解度最小，最容易沉淀析出。 (三) 蛋白质的沉淀反应 蛋白质分子由于形成水化层和双电层而成为稳定的胶体颗粒。但是，蛋白质胶体颗 粒的稳定性是有条件的、相对的。在一定的物理化学因素影响下，蛋白质颗粒失去电荷、 脱