RNA转染树突状细胞瘤苗的研究进展.docVIP

RNA转染树突状细胞瘤苗的研究进展肿瘤免疫。PＢ３　肿瘤总RNA从微量的肿瘤组织中提取肿瘤总RNA，通过PCR方法体外大量扩增，提供足够的肿瘤抗原。Boczkowski等[]提取肿瘤组织冰冻切片的总RNA经RT-PCR和体外转录反应，扩增的mRNA产物冲击DC，可刺激肿瘤特异性的CTL反应，并引起荷瘤小鼠转移灶的退化。编码肿瘤相关抗原（TAA）的m RNAmRNA在体外用适当的引物通过RT-PCR和体外转录获得。Nair等以CEA mRNA、人端粒酶逆转录酶( hTERT) mRNA和自体肿瘤组织总RNA转染肿瘤患者DC，均诱发了特异性CTL，并在体外实验中证明可溶解肿瘤细胞[]。 Heiser等[]用编码PSA 的m RNA转染自体DC，在体外可刺激强大的T细胞介导的免疫反应。. mRNA转染DC的常用方法 目前常用的m RNA转染DCs的方法主要有：脂质体介导的转染、电穿孔法、被动转染。脂质体介导的转染是最为常用的实验室m RNA转染DC的方法Lu等[]将加帽、加polyA尾的mRNA 转录产物与脂质体混合后转染乳腺癌细胞系，结果显示目的基因mRNA高表达。但是，脂质体本身对DCs是有毒性的，过多的脂质体可能对DCs产生影响，另外，脂质体与mRNA的最优化比例亦是一定的，这样就限制了mRNA的用量，同样限制了其的临床应用。电穿孔法作为高效的转染方式，被广泛应用于基础实验研究中。在直流电场作用的瞬间，细胞膜表面产生疏水或亲水的微小通道105～115μm ，这种通道能维持几毫秒到几秒，然后自行恢复。在此期间生物大分子如 可通过这种微小的通道进入细胞Tendeloo等[用电穿孔法将编码Melan-A和EGFP基因的mRNA导入DC，可检测到EGFP基因表达产物，同时刺激了抗原特异性C T L反应。实验结果还显示，以此法进行mRNA转染DC， 其转染效率高于mRNA 脂质体复合物、裸mRNA和电穿孔法质粒cDNA转染的DCGholamin M等将含有EGFP基因的mRNA电转入ＤＣ中，通过流式细胞术检测其转染效率平均可达87.8%，并且在电转后96h检测仍有约30%的细胞表达[13]。 4.3 被动转染 即将裸mRNA与DC共同孵育，利用DC的吞噬作用达到转染的目的。此种方法对DCs损伤较小，操作简单，但转染效率较低，难以激发足够强度的特异性免疫反应。 5 负载抗原后的ＤＣ表型变化 　　　　DC有多种表面标志，包括CD1a、CD34、CD14、CD83、CD54、CD40、CD86、CD11a、CD11c、HLA-DR、CCR7、CD80等，DC的表型变化依赖于其分化和成熟阶段。CD1a优先表达于人骨髓来源的未成熟DC中，而CD83则在受到一些活化刺激时（TNF-α, PGE2, CD40配体和 IFN-γ 等）有显著的上调[14，15]。也有学者研究称CD83在DC培养早期不表达，只在其成熟时才表达，因而可作为DC成熟的标志[16]。未成熟ＤＣ低水平表达共刺激分子（CD80，CD86）以及有限的刺激T细胞增殖的作用，为了增强其免疫原性，通常采用TNF-α、TNF-γ, 或CD40配体来刺激，其活化成熟的标志有CD80, CD83 和CD86 表达上调以及促炎细胞因子（IL-12、 IL-15、 TNF-γ 和 IL-6）的分泌。在DC成熟早期如果没有PGE2的诱导，ＤＣ将不具有趋化性［17］。 通过负载肿瘤相关抗原的mRNA刺激DC成熟同样在实验中得到了验证。Gholamin M 用食管鳞状细胞癌（ESCC）mRNA电转入DC24小时后流式分析CD80、CD86、CD83均显著上调，CD83升高至58.9%，CD14表达降至4.7%[13]。Jarnjak-Jankovic S用Jurkat E6(白血病细胞系)的mRNA电转至DC,流式结果显示CD83 、CD86和HLA-DR表达99%以上，CD1a则表达73%，而CD14表达降至0.9%。该实验还比较冻存前后的成熟DC的表型变化，发现除CD14和CCR7在复苏后有轻微升高外，其他指标相对稳定[18]。越来越多的实验表明了来自肿瘤抗原的mRNA在诱导DC捕获抗原并刺激T细胞产生主动免疫方面有着巨大的潜力。 6 结语 DC诱导免疫激活的功能早已被研究者们所重视, 许多实验在体外和体内运用 DC提呈抗原, 以期产生或增强免疫应答。DC成功诱导体内肿瘤特异性免疫应答受抗原特异性、体外培养方法以及给药途径等多种因素影响，而体外抗原的刺激效果是决定DC瘤苗的基础。mRNA抗原的研究进展大大提高了DC提呈抗原的效率且副作用小，为DC瘤苗的临床应用提供了更好的机遇。但如何提供更有效的肿瘤相关抗原的mRNA，以及如何使其更好的诱导DC，我们仍然有很多需要解决的问题。通过研究