5第三占奥 高效液相色谱(一).ppt

第三章 高效液相色谱分析 高效液相色谱法：流动相为液体并采用高压输液的色谱分析法； 　　又称高压液相色谱。 　主 要 内 容: 高效液相色谱分析法特点； 影响色谱峰扩展及色谱分离的因素； 高效液相色谱的分离原理； 液相色谱固定相与流动相； 高效液相色谱仪；　 高效液相色谱分离类型的选择；　 毛细管电泳。 §3-1 高效液相色谱的特点（high performance liquid chromatography，HPLC） 一、高效液相色谱法简介 1.概述： 高效液相色谱是20世纪60年代末、70年代初发展起来的一项高效快速的分离技术。 纸色谱、薄层色谱→气相色谱→高效液相色谱 2.分类: 按分离原理不同,常用的高效液相色谱有: 液-液分配色谱和键合固定相色谱、液-固色谱、离子交换色谱、离子对色谱、离子色谱及凝胶渗透色谱、亲和色谱等。 3.高效液相色谱与气相色谱比较: （1）应用范围不同 气相色谱仅能分析在操作温度下能气化而不分解的物质。 液相色谱则不受样品挥发度和热稳定性的限制，它非常适合分子量较大、难气化、不易挥发或对热敏感的物质、离子型化合物及高聚物的分离分析，大约占有机物的70~80%。 （2）液相色谱能完成难度较高的分离工作 因为: ①液相色谱中流动相液体也与固定相争夺样品分子，为提高选择性增加了一个因素。 ②液相色谱固定相类型多,分析时选择余地大。 ③ 液相色谱通常在室温下操作，较低的温度，一般有利于色谱分离条件的选择。 （3）由于液体的扩散性比气体的小105倍，分子扩散可以忽略,但传阻力加大。 （4）液相色谱中制备样品简单，回收样品也比较容易，而且回收是定量的，适合于大量制备。 （5）液相色谱尚缺乏通用的检测器，仪器比较复杂，价格昂贵。 在实际应用中，这两种色谱技术是互相补充的。 二、高效液相色谱特点： 1.高压: 150～350×105 Pa 2.高速: 经典液相色谱分离20种氨基酸需20小时;高效液相色谱1小时就可完成。 用梯度洗脱法，可在半小时内分析出尿样中的104个组分。 3.高效：理论塔板数： 气相色谱：2000块/m； 高效液相色谱：3万块/m。 4.高灵敏: 10-9 ～ 10-11 5.可分析高沸点样品: 无机物及80%的高沸点有机物气相色谱无法测定，可用液相色谱测定。 6.室温下进行。 　　　由于上述特点，该法已成为现代分析技术的重要手段之一，目前在化学、化工、医药、生化、环保、农业等科学领域获得广泛的应用。 §3-2 影响色谱扩展及色谱分离的因素 高效液相色谱吸收了气相色谱的理论体系，各种术语及塔板理论、速率理论与气相色谱相同。 不同之处在于液体流动相带来的变化：液体扩散系数小（气体的万分之一至十万分之一）、粘度大、密度大等。 1.涡流扩散项He 与气相色谱相同 He ＝2λdp 2.纵向扩散项Hd 3.传质阻力项 ⑴ 固定相传质阻力项Hs ⑵流动相传阻力项①流动相传质阻力项Hm ②滞留的流动相中的传质阻力项 由于流动相滞留在固定相微孔内而产生的传质阻力。 总方程式： 流速不是很小时： 由此可以看出： ①要提高柱效，需颗粒细小、均匀、孔径大且浅、液膜厚度小； ②提高柱温可加快传质，但使分子扩散增强；一般温下进行； ③降低流速，纵向扩散加大，分析时间延长，故流速不要太慢。 H-u曲线 影响峰扩展的因素还有柱前峰展宽和柱后峰展宽，是由进样和检测器所致，就注意改善进样方式、检测器及连接方式。 　　 注意：随着填料粒度的减小(＜10μm)，两曲线变得基本相似，LC曲线也出现最低点。 §3-2 高效液色谱的分离原理 高效液相色谱主要有以下几类： ①液-液分配色谱及化学键合固定相色谱 ②液-固吸附色谱 ③离子交换色谱 ④离子对色谱 ⑤离子色谱 ⑥空间排阻色谱 一、液-固吸附色谱 （liquid-solid adsorption chromatography） 采用固体吸附剂的液相色谱法。 利用组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸作用力的差异进行分离。 液-固吸附色谱分离原理： 组分溶剂吸附平衡： Xm+ nSa ? Xa+ nSm Xm+ nSa ? Xa+ nSm K大，吸附作用力大，保留值大，后流出； K小，吸附作用力小，保留值小，先流出。 其缺点是易出现拖尾现象。 二、液-液分配色谱