融合基因anti-erbb2scfv-fc-cd28-cd3ζ的-中国细胞生物学学报.docVIP

融合基因anti-erbB2 scFv-Fc-CD28-CD3(ζ)的构建 及真核表达 隋文君, 苏世振, 胡望雄, 李红智*, 布立敬 (温州医学院浙江省重点医学遗传学实验室, 温州325035) 摘要 利用SMODEL预测该融合蛋白的三级结构。利用PCR的方法分别从重组pPIC9k、重组pBullet和pSecTag2B上扩增出3段基因片段，即片段anti-erbB2-scFv(简称A)、片段Fc-CD28-CD3(ζ)(简称B)和信号肽序列(简称S)。利用SOE-PCR将3段序列连接形成融合基因片段S-A-B。经TA克隆扩增及鉴定后，将融合基因片段与逆转录病毒表达载体pLNCX相连构建重组真核表达载体，电转染人淋巴瘤T细胞株Jurkat，G418筛选后用流式细胞术检测融合蛋白稳定表达情况。经预测在anti-erbB2 scFv与Fc基因片段之间不加连接肽的融合蛋白，在三级结构上可形成更佳的功能构象。经PCR、酶切及测序鉴定均证实成功构建重组真核表达载体pLNCX/S-A-B(在A与B基因片段之间不加linker)。经流式细胞术检测，在转染的Jurkat细胞中融合蛋白表达率约为56.17%。应用分子克隆的方法成功地构建了重组真核表达载体pLNCX/anti-erbB2 scFv-Fc-CD28-CD3(ζ)，融合基因能够在淋巴瘤T细胞株中表达，为制备含该融合基因的原代T淋