AMP脱氨酶活性测定的种改进方法.pdfVIP

30 食品与发酵工业 　　Food and Fermentation Industries 　　Vol. 27 　No 7 AMP 脱氨酶活性测定的一种改进方法 刘军昌　段作营 　毛忠贵 (无锡轻工大学生物工程学院 ,无锡 ,214036) 摘 　要 　改进了测定腺苷酸脱氨酶活力的紫外分光光度法 ,探讨了影响酶活测定的因素 ,得 到最佳的酶活测定条件 :酶反应温度 30 ℃,p H 范围 6. 1 ±0 2 ,反应 15 min 加 10 %过氯酸溶 液终止 。此外 ,还考察了各种离子对酶活测定的影响 。 关键词 　AMP 脱氨酶 　酶活性测定 　紫外分光光度法 ( 　　腺苷酸脱氨酶 AMP deaminase , EC 3. 来确定酶活 。为保证酶反应以初速度进行 , 5. 4. 6) 是氨基水解酶的一种 ,在一定条件下 , 并尽量减小仪器误差 ,实验在下述条件下进 它能够定量脱去腺苷酸嘌呤碱基上的氨基 , 行 :底物过量 ,反应液的吸光值在 06 ～08 生成 IMP 和 N H3 [1 ] 。AMP 脱氨酶是核酸酶 之间;反应前后吸光值的改变量在 01 左右 , 解法生产呈味核苷酸的重要酶类之一 。其活 减小操作误差且保证消耗的底物在 20 % 以 性测定方法有氨气定量法和分光光度法[2 ] , 内。 前者用比色法或氨气敏电极来测定 N H3 的 12 　仪器与试剂 量 ,其中比色法实验操作误差较大 ;而以氨气 12 1 　仪 　器 敏电极作为传感器则较难控制电极的响应信 U3000 型分光光度计 , SHZ22 水浴恒 号和响应时间。后者基于 AMP 转化成 IMP 温振荡器 ,PHB2 便携式p H 计 。 时引起 265 nm 处紫外吸收光谱的变化 ,测定 12 2 　试 　剂 酶反应前后 265 nm 处吸光值的变化量 , 由此 5 ’AMP 和 5 ’IMP 从中科院上海生化 来确 定酶活 , 如 Kalckar 法[2 ] 和 Nikiforuk 所东风生化技术公司购得 ; AMP 脱氨酶 , 由 法[3 ] 。Kalckar 法的酶反应在石英比色皿中 本实验室制备 ,其他试剂均为分析纯 。 进行 ,难以保证温度的恒定和均匀混合 ,实际 13 　实验方法 操作困难 ,重复性差 。Nikiforuk 法在反应 30 准确称取 139 mg 腺苷酸溶于 10 mL , min 后终止反应 ,难 以保证反应 以初速度进 008 mol/ L 的 NaHCO3 溶液中作为原始底 行 ,酶活测定结果偏低 。本文对原有的测定 物 ,然后用一定浓度的琥珀酸缓冲液将其稀 方法进行了改进 ,探索出一种方便 、合理 、可 释 400 倍 , 得到终浓度为 01 ×10 - 3 mol/ L 靠的AMP 脱氨酶活性测定方法 。 的反应底物 。移取 3 mL 反应底物在一定温 度下保温 5 min ,加预稀释的 AMP 脱氨酶液 1 　材料与方法 01 mL 立刻计时反应 , 一段时间后加入 3 11 　原 　理 mL , 10 %的过氯酸溶液终止反应 。 5 ’AMP + H O 5 ’IMP + N H 对照实验方法同上 ,反应底物保温后用 2 3 AM