中缅边境地区蝙蝠新型病毒的检测与鉴定.pdfVIP

  中文摘要 中缅边境地区蝙蝠新型病毒的检测与鉴定 蝙蝠为仅次于啮齿类动物的第二大哺乳动物群体，是许多人兽共患病病毒的 自然宿主。目前发现蝙蝠携带的病毒已超过60 种且数量还在不断增加，其中包 括引起人严重疾病的人兽共患病病毒包括尼帕病毒、亨德拉病毒、埃博拉病毒、 马尔堡病毒、狂犬病病毒（Rabies virus ）和狂犬病相关病毒（Lyssavirus ）以及 SARS 样冠状病毒等。因此，全面和深入地研究蝙蝠携带病毒的自然本底对新发 和再发人兽共患病防控具有重要意义。传统的研究方法无法高效地发现大量未知 病毒。以第二代高通量测序为核心的病毒宏基因组学技术相比传统研究方法具有 巨大的优势，已成为研究动物及环境病毒组学的高效工具。 本研究通过对蝙蝠组织样品的处理和 Solexa 高通量测序获得了大量的病毒 序列。在对这些序列进行生物信息学分析的基础上，对不同病毒设计出不同的检 测方案，并从蝙蝠的原始组织样品中鉴定出 1 株 G3P[3] 型 A 群轮状病毒 RVA/Bat/MSLH14 、2 株新型圆环病毒 BtCV XOR1 和 BtCV XOR7 、2 株新型博 卡病毒 BoV XM30 和 BoV WM40 ，完成了对这 5 株病毒的全基因组测序。通过 对轮状病毒 11 条基因节段的分析表明 RVA/Bat/MSLH14 的基因型为 G3-P[3]-I8-R3-C3-M3-A9-N3-T3-E3-H6 ，与泰国人轮状病毒 CMH222 已知的 4 个节段（VP4 、VP6 、VP7 和 NSP4 ）基因型一致。RVA/Bat/MSLH14 与 CMH222 这两株病毒 VP6 节段基因型同为罕见的 I8 型。通过对 RVA/Bat/MSLH14 的VP7 、 VP4 、VP6 基因的系统进化分析表明，本研究发现毒株在 VP4 和 VP6 节段与 CMH222 最为接近，VP7 节段与多条印度的牛源轮状病毒接近。推测本研究发现 的RVA/Bat/MSLH14 可能与泰国的 CMH222 同源，且VP7 节段与印度牛源的轮 状病毒重配。圆环病毒 BtCV XOR1 和 BtCV XOR7 均为新的圆环病毒种，BtCV XOR7 与猪圆环病毒 （PCV ）处于同一分支，具有 70% 的Rep 蛋白氨基酸同源性， 基因组大小和分子特征相似。博卡病毒 BtCV XOR1 和 BtCV XOR7 两株病毒处 于同一个小的分支，与其它已知的博卡病毒序列核苷酸同源性和氨基酸同源性低 于 60%，为新的博卡病毒种。 为分离获得轮状病毒，将含轮状病毒阳性的肠道样品处理后接种 Marc-145 细胞，当病毒盲传到第 3 代时出现明显的 CPE 。细胞培养物RT-nPCR 检测结果 I     为 RV 阳性。测序确认其序列与 RVA/Bat/MSLH14 同源性 100%。电镜观察到细 胞培养物中的病毒粒子，无论是大小还是形状都与典型的轮状病毒相符合。通过 细胞超薄切片观察到细胞内囊泡包裹着的聚堆的病毒粒子。核酸 PAGE 电泳鉴定 出带型为 4-2-3-2 的 11 条节段，与 A 群轮状病毒相符。通过肌肉注射免疫青年 鼠的方式获得了该病毒的抗血清，建立了间接免疫荧光（IFA ）检测方法。将病 5.5 5.3 毒传代培养，并测定出 F4 、F6 、F8 和 F10 代细胞毒的滴度分别为 10 、10 、 6 7.5 10 和 10 TCID50/ 100 μl 。 为初步研究 RVA/Bat/MSLH14 的细胞感染谱和对乳