人冠状病毒NL63受体结合区蛋白的原核表达纯化与初步应用.pdfVIP

中文摘要 人冠状病毒 NL63 受体结合区蛋白的原核表达纯化与初步应用 人冠状病毒 NL63 是有包膜的单股正链 RNA 病毒，系统分类学上属于冠状 病毒 ɑ组。棘突蛋白是病毒表面长的花瓣样结构，在电子显微镜下形似王冠，是 以三聚体形式存在的膜锚定的糖蛋白。S 蛋白在病毒与细胞受体吸附、膜融合过 程中发挥重要作用，同时介导不依赖补体的中和抗体的产生。经研究，棘突蛋白 是决定病毒组织嗜性和病毒毒力的主要因素。同其他冠状病毒一样，HCoV-NL63 S 蛋白可分为两个亚结构域，分别是位于N 端的包含受体结合区（Receptor binding domain,RBD ）的 S1 区（21～717aa ）；和位于C 端的包含跨膜区（Transmembrane domain,TMD ）的 S2 区（718～1356aa）。其中，S1 区介导病毒与受体的识别和 结合，S2 区则与细胞融合有关。对 HCoV-NL63 RBD 的分析表明最基本的受体 结合区域位于 S1 区中 476～618aa （RS ），但较大的受体结合区片段（RL ，232～ 684aa ）与人血管紧张素转换酶（Human angiotensin-converting enzyme,hACE ）2 的结合能力明显优于RS 。 本研究在 E.coli 系统中进行人冠状病毒 NL63 受体结合区（RBD ）大、小蛋 白的表达纯化，进行免疫学鉴定，将重组蛋白用于测定HCoV-NL63 基因工程疫 苗免疫小鼠后血清中的抗体滴度并将其用于检测人群血清中的特异性抗体。 上述研究结果为深入研究 HCoV-NL63 感染流行规律、RBD 的生物学功能及 疫苗研发提供了基础。 首先，利用本室前期密码子优化合成的 HCoV-NL63 S 基因序列，设计受体 结合区 RBD(RL) （232～684aa ）、RBD(RS)(476～616aa)蛋白编码基因的特异性 引物，并在 5 ＇端与3 ＇端分别引入NcoI 、XhoI 酶切位点。利用 PCR 对片段进 行扩增，酶切扩增片段以及表达载体 pM48 ，连接转化。挑取单克隆进行酶切鉴 定并测序，成功获得表达质粒 pM48-RS 与 pM48-RL 。 将上述重组表达质粒转化大肠杆菌 BL21 （DE3 ）plysS ，经过优化表达条件， 确定最佳诱导表达条件为 37℃，0.8mM IPTG 诱导 4h 时，蛋白表达量达到最高， 融合蛋白主要以包涵体形式表达。 I 将上述重组蛋白超声后收集的沉淀溶解在 6M 盐酸胍中，进行亲和层析后获 得纯化的 RS 与 RL 融合蛋白，经分析，蛋白纯度大于 95% 。Western blot 显示， 两个融合蛋白均与痘苗病毒（天坛株）表达的相应蛋白免疫的小鼠血清发生特异 性反应。 将纯化的重组蛋白 RS 与 RL 应用于 HCoV-NL63 基因工程疫苗免疫小鼠后 血清中的抗体滴度的测定，检测结果显示，质粒免疫和痘苗病毒联合免疫后小鼠 血清中的抗体水平比单独质粒免疫后小鼠血清中的抗体水平高。 将融合蛋白作为检测抗原，我们建立了 WBLA(Western Blotting Line Assay) 检测方法，并用该方法检测了 30 份正常成人血清中人冠状病毒 NL63 特异性抗 体，30 份血清中，用 RL 检出 18 份阳性血清，检出率为 60% ；RS 检出 18 份阳 性血清，检出率为 60% ；IFA 检出 18 份阳性血清，检出率为 60% 。基于RL 与 RS 的 WBLA 检测符合率为 79.15% ； 基于 RL 的 WBLA 及基于 RS 的 WBLA 与 IFA 的符合率为 58.33% 。并应用重组蛋白作为包被抗原为间接ELISA 检测方 法的建立做了初步探索。 关键词： HCoV-NL63 ，RBD ，大肠杆菌，蛋白表达纯化，疫苗，血清学检测 I I