枯草芽孢杆菌关键遗传调控元件及表达系统的研究.pdf

Classification code: S816.35__ University code: 10712 UDC: 579.6 Postgraduate number: 2009060137 Confidentiality level: Open Dissertation for Doctor Degree Northwest A ＆F University in_2013__ STUDY ON KEY EXPRESSION ELEMENS AND EXPRESSION SYSTEM IN BACILLUS SUBTILIS Major: Animal nutrition Research field: Mlecular nutrition Name of Postgraduate: Yang Ming-ming Adviser: Chen Yu-lin Co-adviser: Date of submitted: 2013/11/13 Yangling Shaanxi China 本研究由国家自然科学基金面上项目）资助完成 枯草芽孢杆菌关键遗传调控元件及表达系统的研究 摘 要 枯草芽孢杆菌广泛存在于土壤和动物胃肠道。因其易于分离培养，具有较清晰的遗 传背景和良好的分泌性，又无致病性等特点，已成为生物技术基础研究和应用研究中使 用较多的重要菌种。而且，枯草芽孢杆菌作为益生菌和饲用酶产生菌越来越多的被应用 于畜禽生产中。为此，需要针对枯草芽孢杆菌载体、表达元件以及遗传操作方法等关键 环节，建立较为完善的枯草芽孢杆菌遗传操作系统。本研究围绕构建新的枯草芽孢杆菌 质粒载体，构建以麦芽糖利用操纵元启动子为调控元件的表达载体，并基于枯草芽孢杆 菌的电转化整合和定点突变，进一步优化表达系统。同时，期望克隆筛选获得强启动子 元件作为枯草芽孢杆菌的调控元件。取得的主要研究结果如下： 1. 把具有完全复制功能的 700 bp 大肠杆菌 ColE1 复制子与 2500 bp 枯草芽孢 杆菌质粒复制子连接，成功构建了 E. coli-B. subtilis 穿梭载体 pGJ103 。利用 B. subtilis 麦芽糖操纵元启动子和穿梭载体 pGJ103 ，成功构建了B. subtilis表达载体 pLJ ，利用其 在枯草杆菌中高水平表达了 β-半乳糖苷酶、BioA 和 VHB 等蛋白。另外，证明葡萄糖 严重抑制 pLJ 的表达。 2. 通过降低盐离子浓度,提高细胞活力,在枯草芽孢杆菌中建立了优化的电转化整 合方法。并据此实现了在 B. subtilis 基因组 DNA 中的环形 DNA 单交叉整合和线性 DNA 双交叉整合，敲除了 B. subtilis 早期生孢基因，获得了枯草芽孢杆菌生孢基因缺 失株 B. subtilis GJ09 。 3. 以β-半乳糖苷酶编码基因为报告基因，对枯草芽孢杆菌麦芽糖操纵元启动子进行 了定点突变。正突变子 pJRINM1 在 B. subtilis 1A747 中实现了 β-半乳糖苷酶高效表 达，其表达量占总可溶性蛋白的 18% ，5% 的麦芽糖诱导 24 h 酶活达到 14 U/mL 。同 时，基于同源重组方法，用枯草芽孢杆菌组成型启动子 P43 替换了野生型菌株 B. subtilis 1A747 的麦芽糖操纵元上游调控序列，获得了优化重组表达宿主菌B. subtilis BCYL 。将 pJRINM1 转入 B. subtilis