半乳糖苷酶Procudure.PPT

加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二抗冲洗掉。二抗只识别一抗。 二抗上联着一种酶（碱性磷酸酶、过氧化物酶、脲酶等）。 （3）二抗结合 二抗 加入无色的底物，被二抗上所带的酶催化反应转变成有色物质（或发光）。 （4）显色反应 在特殊的分光光度仪（酶标仪）上比色，打印出结果。 （5）比色 3.ELISA的局限性 有效，但准确性稍差（主要取决于一抗的特异性）。 必须与其他方法一起综合考虑。 最好用单克隆抗体（monoclonal antibody） 四、免疫印迹（western blot）法 1.原理： 在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫的方法检测胶上的蛋白质泳带。 （1）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的蛋白质维持线性状态，并与蛋白质结合，使蛋白质带上负电荷。 ① SDS: （SDS）： ② 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）： （Polyacrylamide gel electrophoresis） 在电场的作用下线性蛋白质链在聚丙烯酰胺凝胶介质中向正极移动，移动的速率主要取决于其分子量大小（链的长短），从而把不同分子量的肽链分开。 电泳buffer 电泳buffer 点样 电泳方向 ③蛋白质电泳的分子量标准 已知分子量的蛋白质混合液，与待测样品一起电泳，为样品蛋白质提供分子量估计。 商品化供应 Da 道尔顿(质量单位, 等于一氧原子质量的十六分之一。 一克约为6×1023道尔顿 Dalton SDS PAGE ④凝胶中的蛋白质染色： 考马斯亮蓝： 灵敏度底、只能检出0.3-1μg/带，但可褪色回收。 硝酸银： 灵敏度高、可检出2-5ng/带。 2）转到膜上进行染色。 1）直接染色 直接染色电泳结果 （2）Western blotting 电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，转到膜上（硝酸纤维素膜、PVDF膜、中性尼龙膜等）。 ① Western（转膜） 胶里的蛋白质带在电场的作用下横向转移到正极一侧的膜上。 膜 胶 蛋白 Western装置 ② Blot 原理与ELISA相同。 待测蛋白 硝酸纤 维素膜 一抗 二抗 辣根过氧 化物酶 底物 产物， 并发出光 PAGE胶 待测蛋白 底片曝光 辣根过氧化物酶：HRPO 1）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与 膜上的蛋白结合。 2）洗去未结合的一抗。 3）用二抗与一抗结合（二抗上带有HRPO）。 4）清洗掉未结合的二抗。 5）用HRPO的底物浸泡膜。 6）暗室里曝光，冲洗胶片。 ③ Blotting过程 Immuno Blotting ④结果 多克隆抗体Blotting的结果 单抗blotting结果 4. DNA sequencing DNA sequencing Two main methods: Maxam and Gilbert chemical method the end-labeled DNA is subjected to base-specific cleavage reactions prior to gel separation. Sanger`s enzymic method (?) the latter uses dideoxynucleotides as chain terminators to produce a ladder of molecules generated by polymerase extension of primer. G A T C T C G A T C T C G G CH3 T C T C G A T C T C G A DNA labeled at one end with 32P Base modification Release or displace- ment of reacted bases Strand scission Maxam and Gilbert chemical method 32pGpCpTpGpCpTpApGpGpTpGpCpCpGpApGpC 32p 32pGpCpTp 32pGpCpTpGpCpTpAp 32pGpCpTpGpCpTpApGp 32pGpCpTpGpCpTpApGpGpTp 32pGpCpTpGpCpTpApGpGpTpGpCpCp 32pGpCpTpGpCpTpApGpGpTpGpCpCpGpAp 32pGpCpTpGpCpTpApGpGpTpGpCpCpGpApGpC Chain cleavage at guanines Maxam-Gilbert sequencing.We methylate guanines with a mild DMS treatment that meth